Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

酵素反応 / 不斉脱炭酸反応 / 基質特異性 / ランダム変異 / 部位特異的変異 / プラスミド / 不斉脱炭素反応 / 活性部位特異的阻害剤 / 立体配座 / 活性化エントロビ- / CH-π相互作用 / チオールエステル結合 / システイン

我々が発見した二置換マロン酸を不斉脱炭酸する酵素(AMDase)は補因子を全く必要としない非常にユニークな脱炭酸酵素であり、240個のアミノ酸からなる。4個含まれるシステインの内1個が活性部位にあって、反応に重要な役割を担っていることが明らかになっている。部位特異的変異によってこれらのシステインのうち何れか1個だけをセリンに変えた変異酵素4種類を作ってその活性をそれぞれ調べた。その結果、N端から数えて188番目のCysをSerに変えると活性が極端に小さくなることが明らかになった。この事から、このCysが酵素活性に直接関与していると推定できる。
基質である二塩基酸がどの様に酵素の活性部位に結合し、またシステインが基質を活性化するのにどの様な役割を果たしているかは非常に興味がもたれるところである。これらのことについて様々な基質や阻害剤を利用して詳細に検討した。まず、基質の活性部位内での立体配座であるが、幾つかの化合物の反応性、ミカエリス定数等からベンゼン環がある配座に固定されているだろう事が推定できた。その固定のための少なくとも1つは、酵素の芳香族アミノ酸残基と基質のベンゼン環の間に形成されるCH-p結合であることがあきらかとなった。
酵素をコードする遺伝子のランダム変異によって基質特異性を変化させる試みを行った。具体的には、2重鎖DNAに亜硝酸を作用させた。その遺伝子断片を再びプラスミドのつないで大腸菌を形質転換し、メチル基の代わりにエチル置換基を有する化合物に対して活性を有する株を検索した。残念ながら、7000株の中から目的のものを見つけることはできなかったが、野生株より活性の高い酵素が見出した。

酵素反応 / ガラクトースオキシダーゼ / グルコースオキシダーゼ / 微生物 / 高選択的分離 / 脱水素 / 選択的資化 / 糖質 / 酵素 / 基質特異性 / 選択的脱水素 / 選択的分解資化 / 選択的酸化 / ウロン酸 / 非天然糖 / オリゴ糖 / L糖

微生物の酵素による高選択的脱水素(酸化)と天然、非天然型糖質のもつ分子構造的特徴と酸化反応における酵素のもつ分子識別能及び選択性との間の相関に対し、基礎的知見を集積するとともに、化学の側から見た酵素反応について一段階反応から多段階反応まで含めて考察を行った。
はじめにグルコースオキシダーゼ及びガラクトースオキシダーゼの基質特異性について検討を行い、生成物の分析を行った。その結果ガラクトース、マンノース及びキシロースはグルコースオキシダーゼにより相当するラクトンに高収率で酸化された。メチルD-ガラクトシドのC-6ヒドロキシメチルはガラクトースオキシダーゼによりアルデヒド中間体を経て相当するウロン酸に酸化された。分子中にガラクトピラノシル残基を有するオリゴ糖もガラクトースオキシダーゼにより酸化された。これとは対照的に、ガラクチトールやヤシリトールのようなある種の糖アルコールはガラクトースオキシダーゼにより酸化されてL-ガラクトースやL-キシロースのようなL-糖が選択的に得られた。この場合、生成したL-ガラクトース及びL-キシロースはピラノース環を形成することにより安定化し、これ以上の酸化が進行しないものと考えられる。
もし糖質が好気的条件下で資化されるとすれば、全反応は酸化反応(多段階的脱水素)とみなせるであろう。特定の菌体を用いて高選択的資化を、従来の化学的手法では困難な炭水化物の選択的分離に適用した。D-アロース資化菌、Rhodotorla rubra KM603、Trichosporon cutaneum KM609及びAcremonium sp.KM608を活性汚泥より集積培養法により得、糖質のC-2エピマー、α、β-アノマー及びDL-混合物の分離を行った。さらに他の特定の微生物について選択的資化性の検討を行った。

【研究分担者】
吉川貞雄	慶応義塾大学	理工学部応用化学科	教授	(Kakenデータベース)