【研究領域課題番号】21K16135 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肺腺癌 / 切除検体 / 膜タンパク / Recurrence－free survival / 肺癌 / バイオマーカー

【研究成果の概要】

2021年度には、標的遺伝子である Nectin 2 について、当研究室で保存しているヒト肺腺癌切除検体を用いて遺伝子発現量を測定し、臨床病理学的特徴、予後との関係を検討した。肺腺癌手術検体 105例を無作為に抽出し、定量的 RT-PCR によって Nectin 2 発現量測定行った。Nectin 2 発現量と再発の有無について receiver operating characteristic (ROC) 解析を用いて高発現群と低発現群に分けて Kaplan-Meier 法により Recurrence－free survival を比較し、Nectin 2 高発現群は低発現群に比べて全症例、I 期症例において有意に Recurrence－free survival が短いという結果が得られた。この結果は、TCGA database を用いた in silico での解析結果と一致しており、研究結果が妥当であることを示している。
さらに、当研究室に保管されている肺癌細胞株を用いて Nectin 2 の発現量を比較した。Nectin は 1-4のサブタイプが存在するため、Nectin 2 以外の Nectin の発現量についても検討を行った。また、Nectin 2 に対するノックアウト実験のために CRISPR-Cas 9 ゲノム編集用ベクターを作成し、Nectin 2 高発現株に対してトランスフェクションを行った。シングルセルコロニーから培養を行うことにより、PVRL2 ノックアウト肺癌細胞株の作成を開始した。
Nectin 2 のノックアウトを確認するために、ウェスタンブロットが必要と考えられ、Nectin 2 に特異的に作用する抗体を購入し、抗体がワークすることをウェスタンブロットで確認した。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究領域課題番号】21K08200 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

間質性肺炎 / 肺癌 / バイオマーカー / 肺線維芽細胞 / 非小細胞肺癌 / 肺線維症 / 線維芽細胞

【研究成果の概要】

間質性肺炎は喫煙とは独立した肺癌の危険因子の一つであるが、両疾患を結びつける分子病態は未解明の部分が多い。両疾患をリンクする新規機序を探るために、公共データベースを用いた解析を行い、BMPアンタゴニストの一つであるGREM1（Gremlin-1）に注目した。
今年度はまずGREM1の間質性肺炎における役割を明らかにするために、GREM1の発現解析及び機能解析を行った。特発性肺線維症(IPF)患者から得られた肺組織のscRNA-seqの公共データを用いて、肺のどの細胞でGREM1が発現しているのか調べたところ、肺/気管支上皮細胞、血管内皮細胞、免疫細胞では低発現であり、肺線維芽細胞で比較的特異的に高発現であることが分かった。その中でも筋線維芽細胞の一部で特に発現が高く、一部のコラーゲンや細胞外基質の遺伝子発現と相関していた。また、IPF患者の肺を用いたRNA-ISH及び免疫組織染色を行ったところ、fibroblastic fociにおける肺線維芽細胞においてRNA、蛋白両者の発現を認めた。
細胞実験では、qRT-PCRを行い、GREM1は気管支上皮細胞株や肺胞上皮癌細胞株では低発現、肺線維芽細胞で高発現であり、TGFβ刺激により発現が亢進することが示された。Recombinant human Gremlin-1を肺線維芽細胞に投与することで、筋線維芽細胞のマーカーであるα-SMA発現の上昇やコラーゲンゲル収縮能の亢進が認められた。一方、細胞増殖能やスクラッチアッセイでの遊走能に関しては有意な影響は認めなかった。現在GREM1に対するsiRNAを用いて、各種コラーゲンやα-SMAの発現、コラーゲンゲル収縮能などに与える影響を調べている。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究領域課題番号】20K07378 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TFFファミリー / バイオマーカー / アポトーシス / abortive cell cycle / 増殖抑制 / 浸潤能 / Trefoil factor / 肺癌 / mTOR / 転写制御 / AKT / microRNA

【研究成果の概要】

我々は培養細胞とヒト肺癌でTrefoil factor (TFF) family蛋白質の機能解析を行っている。これまでの基盤研究で、i) TFF1の腺癌細胞特異的な発現、ii) TFF1過剰発現による細胞増殖抑制、細胞死の亢進、iii) 肺癌患者における血清TFFの高値、等を明らかにした。本年度は培養細胞でTFFの発現による遊走、浸潤の変化、ヒト肺癌組織での発現様式を解析した。[方法]　1. TFF1の構成的過剰発現培養細胞株を樹立し、TFF1の細胞増殖に及ぼす影響を細胞数計測とCKK assayで検索した。またsiRNAも用いて遊走能の変化をscratch assay、浸潤能をmatrigelで解析した。2. flow cytometryによりTFF1発現細胞の増殖と細胞死の機序を解析した。3. 肺癌組織100例における免疫組織化学的発現を検索し、患者血清、尿のTFF1-3レベルと比較検討した。[結果]1. TFF1発現株では小細胞癌(SBC5)、扁平上皮癌(LC-AI)いずれでも遊走能、浸潤能は抑制され、これは特異的siRNAの導入で回避された。2. FACS解析ではTFF1導入により細胞周期の回転は促進されるがアポト－シスの亢進によるabortive cell cycleで、結果的に増殖は抑制された。3. 血清、尿のTFF1-3の組み合わせにより癌患者をAUC=0.825という高値でスクリーニングできた。4. またTFF1, TFF2はpTis/pT1, pN0/1とう早期癌患者で高く、一過性の上昇を示す結果であった。5.患者手術材料のTFF1-3に関する免疫染色ではTFF1-3は全組織型の肺癌組織で発現を認め、TFF1,3は血清レベルと相関したが、TFF2は逆相関した。 [結論] TFF1は肺癌では増殖、浸潤能に抑制性に機能し、臨床病理学的にもTFFsは有力な肺癌のバイオマーカーとなる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究領域課題番号】19K07884 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

腫瘍学 / 分子標的治療 / 腫瘍マーカー / 新規治療分子 / バイオマーカー / 肺がん

【研究成果の概要】

バイオマーカーとして、Exosomeの中に含まれる核酸をDigital PCRを用いて検出しえた。 血中自己抗体:ガン細胞由来の微量タンパクに対して産生される自己抗体を、ELISAで抽出しえた。
治療標的分子の探索、臨床応用：がんに特異的に発現する候補タンパクを同定し、siRNA, Flow cytometry, live cell imagingなどで機能解析を行い、論文、学会での報告を行った。URST1は、肺がんで高発現し、URST1発現が予後不良に関係した。URST1の阻害剤ががん細胞の増殖を抑制した。別の候補OASEP1も肺がんの有望な治療標的分子であり、そのレセプターを同定した。

【研究の社会的意義】

エキソソーム中などに含まれる核酸や血中自己抗体を用いて、がんを早期に検出することは、治癒可能な早期に肺がんを発見可能とし、予後改善につながってくる。一方、がんに特異的な発現をし、正常組織での発現が少なければ、有望ながんの治療標的分子候補となり得る。このような治療標的分子を阻害剤で抑制しても、正常組織への影響は少なく、特異的にがんの増殖を抑制することが可能であり、有望な治療法となりうる。がんの治療は、初回、２回目の治療までは一定の効果はあるが、再発も多く、正常組織への影響の少ない治療薬を長く使用できるようにすることはがん患者の予後改善に有用であると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究領域課題番号】19K07469 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肺癌 / 免疫治療 / 多領域シーケンス / PD-1 / PD-L1 / 免疫療法 / バイオマーカー / 多領域シークエンス

【研究成果の概要】

本研究では、治療効果のみられたがん領域と治療効果のみられなかったがん領域において、550個の発現変動遺伝子(DEG)が確認された。その中で、GO解析の結果、'extracellular matrix organization', 'extracellular structure organization'といったGO termが治療効果のみられたがん領域に優位に濃縮され、KEGG pathway解析では、'Focal adhesion'や'PIK3-AKTシグナル(が優位に濃縮されたパスウェイであった。さらに、免疫治療完全寛解例では、MT-ATP8低発現とMZB1 が高発現することが示された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】病態検査学

【研究領域課題番号】16K08928 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

高感度バイオマーカー / 肺がん / バイオマーカー / 新規治療標的分子 / トランスレーショナルリサーチ / 癌 / 遺伝子 / マイクロアレイ / 臨床

【研究成果の概要】

URST1は、肺がん、口腔がん、乳がんのいずれにおいても、がんで高発現し、siRNAにてURST1を抑制するとG2/M arrestによりがん細胞の増殖を抑制した。免疫組織染色での検討では、上記がんのいずれにおいて予後マーカーであった。URST1に対する阻害剤をによりがん細胞の増殖が有意に抑制され治療薬として有望であった。KIF11も口腔がんで高発現し、がんを増殖させること、阻害剤によりがん細胞の増殖抑制効果を確認できたため、論文報告をおこなった。
高感度マーカーの探索として、肺がん患者20症例について、がん組織とエクソソーム中のURST1 mRNA濃度を同時に測定し、高頻度に検出しえた。

【研究の社会的意義】

上記の候補を含めて、約10種類の予後マーカー、治療標的分子について研究を進めており、阻害剤を用いたin vitroの検討において、がんの増殖抑制効果を確認できており、治癒可能性が低い進行がんの治癒、延命に向けて有効な治療法のひとつとなりうると考えられる。また、予後マーカーを用いて予後を予測することで高危険度群の選別して、徹底した経過観察、治療強度の選択の一助になるものと考えられる。血清中Exosomeを抽出しmRNA、タンパクを検出することは、これまでのバイオマーカーの検出限界を超えうるものである。
新規治療薬、早期診断により、効果的な治療計画を選択すれば、医療費の削減にもつながると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】腫瘍診断学

【研究領域課題番号】25830098 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肺がん / マイクロRNA / 選択的ポリアデニル化 / 転写後制御 / バイオマーカー / 非小細胞肺癌

【研究成果の概要】

近年がんにおいて3’UTRが短縮し（Alternative polyadenylation, APA）、miRNA結合部位が失われることで、miRNAを介した転写後制御が破たんするとの報告がなされた。肺がんにおけるAPAの全貌を明らかにするために、公開されているマイクロアレイデータベースを利用し、肺がんにおいて最もAPAを生じている遺伝子を同定した。肺がん手術検体を用いて解析すると、APAは肺がんの独立した予後不良因子となっており、さらにはPABPN1低発現と増殖マーカー高発現がAPAと相関していた。本研究により肺がんにおけるAPAの全体像が明らかとなった。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2015-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】内科学一般(含心身医学)

【研究領域課題番号】22890085 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肺がん / バイオマーカー / 癌 / トランスレーショナルリサーチ

【研究成果の概要】

肺癌cDNA microarray解析結果から、肺がんで高度に発現し、正常臓器での発現が低い分泌蛋白LASEP3(Lung Cancer Associated Serum Protein3)を同定した。免疫組織染色による検討で、LASEP3は、非小細胞肺がんの組織で高発現を認め、また、予後不良因子であった。ELISA法により非小細胞肺癌患者LASEP3の血清濃度を検討したところ、LASEP3陽性率は61. 8%であった。肺癌細胞株におけるLASEP3の発現をsiRNAで阻害したところ、有意に細胞増殖が抑制された。LASEP3は肺癌の有用な新規血清バイオマーカーであり、非小細胞肺がんの組織予後マーカー、治療標的分子候補であると考えられた。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】2,860千円 (直接経費: 2,200千円、間接経費: 660千円)