【研究領域課題番号】18K06196 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム合成 / コンティグDNA / 枯草菌 / 応用微生物 / 形質転換 / 核酸 / ゲノム / バイオテクノロジー / 溶菌 / 長鎖DNA / 培養細胞

【研究成果の概要】

物理的なダメージを受けやすいサイズの大きなDNAを効率良く細胞中で合成する方法として、枯草菌を用いたプロトプラスト法による形質転換で、一度に複数のコンティグDNA断片を細胞中で連結する手法を考案した。また供与菌宿主として枯草菌を溶菌させ、溶菌液を用いて抽出・精製操作を経ずに大腸菌、出芽酵母へ導入する方法も開発できた。さらに接合伝達法についても大腸菌から真核細胞の酵母へ簡便に長鎖DNAを導入できることが実証され、自然界におけるDNAの水平伝播の原理を応用したゲノム合成法の基盤技術を開発することができた。しかし動物培養細胞への導入については未だ成功しておらず、さらなる条件検討が必要である。

【研究の社会的意義】

生物の設計図であるゲノム配列を簡単に解読できる時代に突入した。次の段階としてゲノム（長鎖DNA）を設計・合成し、細胞導入する研究が世界各国で進行している。しかしあまり認識されていないが、DNAは長くなればそれだけ物理的な衝撃に弱く扱いが難しくなる。本研究の成果は簡便に「長鎖DNAを合成する」だけでなく、合成後の「長鎖DNAを如何に目的の宿主に導入するか」を解決する上で重要な基盤技術を提供する。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】遺伝・染色体動態

【研究領域課題番号】16K07454 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

渦鞭毛藻 / サンゴ / 紫外線吸収物質 / 褐虫藻 / ゲノム / ポリケチド / 多様性 / 遺伝子クラスター / エピジェネティックス / エピゲノム / ヒドロキシメチルウラシル / メチルシトシン / 核ゲノム / 酵素 / 核酸 / エピジェネティクス

【研究成果の概要】

サンゴに共生する渦鞭毛藻類の褐虫藻Symbiodiniaceaeは、少なくとも15のグループに分けることができるが、そのゲノム多様性やエピゲノムに関する研究は進んでいない。本研究では褐虫藻2種の全ゲノム配列（767 Mbと705 Mb）を決定した。比較解析により、二次共生により紅藻から獲得したと考えられる遺伝子の重複や損失が褐虫藻の多様化に影響してきたことを明らかにした。解読した褐虫藻ゲノムを利用し、毒合成を含む二次代謝産物ポリケチドの合成に関わる酵素遺伝子群を明らかにした。今後は、報告したゲノム基盤を使って、褐虫藻のエピゲノムの多様性の比較解析を展開していくことが可能である。

【研究の社会的意義】

サンゴには複数の種類の褐虫藻が共生していることが知られている。これまでは、サンゴと褐虫藻の共生関係の崩壊により引き起こされる白化現象の分子メカニズムを研究する上での褐虫藻のゲノム情報基盤が不足していた。本研究における2種の褐虫藻ゲノムの報告は、今後、サンゴ白化現象の分子メカニズムをゲノムや代謝産物レベルで解析する上での研究基盤を提供しており、学術的意義が高い。また二次代謝産物ポリケチドの合成に関わる酵素遺伝子群を網羅的に解析したことは、有毒渦鞭毛藻による食中毒や赤潮の問題に分子レベルの研究から取り組んで行く上でのよい比較データを提供しており、社会的意義があると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】ゲノム生物学

【研究領域課題番号】15H04319 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

CRISPR / dCas9 / base-pairing / thermodynamics / melting temperature / バイオテクノロジー / 遺伝子 / 核酸 / ゲノム / RNA

【研究成果の概要】

本研究は、CRISPR法の改良による次世代型ヒト遺伝子機能解明のための基盤技術の開発を目的とした研究である。CRISPRシステムとは、原核生物の免疫防御システムを利用した新しいゲノム編集法であり、あらゆる生物種に応用可能な画期的技術として注目されている。CRISPR法では、標的部位を塩基配列で識別するガイドRNAがCas9たんぱく質と複合体を形成し、ガイドRNAが対合したゲノム領域をCas9が切断する。そのため、本研究ではゲノム切断活性を伴わないdCas9を用い、実験的手法とバイオインフォマティックスを用いた手法を組み合わせることで、ゲノム編集効率が高く実用的な手法を確立することに成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】19,110千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 4,410千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】15H02190 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNA / メチル化 / 脱メチル化 / ヒストン / 金属反応 / ペプチド合成 / エピジェネティクス / 化学合成 / イメージング / DNAメチル化 / 金属錯体 / RNA修飾 / ＤＮＡメチル化 / ＲＮＡ修飾 / 核酸 / 有機化学 / 癌 / ゲノム / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

われわれが開発した化学反応を基礎にして、高効率なエピジェネティクス検出研究を進めた。成果は次の通り。課題(i) 腫瘍不均一性を解くためのDNA反復配列に現れるメチル化の超高輝度検出、課題(ii) 腫瘍術後診断を効率化するDNA脱メチル化特異的反応生成物の超高性能分析、課題(iii) 遺伝子発現を制御するヒストン構造の化学的再現と解析

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】42,770千円 (直接経費: 32,900千円、間接経費: 9,870千円)

【研究分野】システムゲノム科学

【研究領域課題番号】26430197 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ダイレクトクローニング / 大腸菌 / 枯草菌 / 応用微生物 / 形質転換 / 核酸 / ゲノム / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

微生物間におけるDNAの水平伝播を模して、DNAを抽出・精製することなく、迅速かつ簡便に他の宿主に移行する「細胞間ダイレクトクローニング技術」の開発において、プラスミドDNAを保持する大腸菌をビルレントファージによって溶菌させ、溶菌液を直接用いて枯草菌を形質転換させる詳細な条件検討を行い、効率良くプラスミドDNAを大腸菌から枯草菌へ送り込む最適条件を確立することができた。連続的に用いることで枯草菌のゲノム中に外来のDNAを再構築させる実践的な活用法も開発した。さらに大腸菌→シアノバクテリアでも実施可能であり、汎用性の広い技術として今後広く活用されることが期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)

【研究分野】ゲノム生物学

【研究領域課題番号】23510234 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

mRNA品質管理 / 生殖細胞 / エキソン連結部複合体 / 細胞質スプライシング / 線虫 / 異常スプライシング / 性決定遺伝子 / RNA品質管理 / 遺伝子 / 核酸 / ゲノム / 発現制御 / 性決定

【研究成果の概要】

mRNA前駆体のスプライシング後のエキソン連結部に形成されるエキソン連結部複合体（EJC）の構成タンパク質であるY14の発現を阻害した線虫C. elegansでは、イントロンを含むスプライシング未完了RNAが細胞質に漏出することが明らかになった。さらに、これらのスプライシング未完了RNAの中には、細胞質において小胞体タンパク質IRE-1によってプロセシングを受けるものが存在することが示唆された。以上の結果は、Y14を含むEJC中核因子がイントロンを含むRNAの核外漏出を防ぐことによって、遺伝子発現の正確性を保証するゲートキーパーとしての新規機能を持つことを示唆している。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)

【研究分野】応用ゲノム科学

【研究領域課題番号】23710239 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

応用微生物 / 核酸 / ゲノム / バイオテクノロジー / 形質転換

【研究成果の概要】

水平伝播を利用した次世代型クローニング技術開発に向けて、供与菌(大腸菌)と受容菌(枯草菌)の適切な培養条件を確立するとともに、安定なDNAの移行操作についての菌株の種類やヌクレアーゼ阻害剤の効果を明らかにすることができた。特にビルレントファージ(λgt10)による溶菌システムを開発したことで、プラスミドを保持する既存の大腸菌株(ライブラリー)を手軽に使用することが可能となった。さらにエキソヌクレアーゼが高効率化のための促進剤として効果的であることも判明した。以上本研究によりDNAを精製せずに簡便に他の宿主に移行させる「水平伝播を利用したクローニングシステム」の基盤技術を確立できた。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】23350081 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核酸 / 酵素 / タンパク質 / ＲＮＡ / RNA / RNA修飾 / RNAメチル化 / tRNA / メチル化酵素 / RNA分解制御 / ゲノム / 構造解析

【研究成果の概要】

本研究は、「RNA成熟システムの全体像を物理・化学的手法で包括的に理解する」ことを目標とした。申請は、３年間の短期申請で、生命の３つのドメイン（真正細菌、古細菌、真核生物）で起源生物に近い単細胞生物のRNA成熟システムを中心に調べた。RNA成熟に関わるtRNA修飾酵素、tRNAスプライシングエンドヌクレアーゼなどについて、X線結晶構造解析、生化学的解析を併用して、その性質を明らかにした。また、遺伝子破壊株解析からRNA修飾ヌクレオシドと修飾酵素のネットワークの環境応答を明らかにした。さらに、古細菌tRNAの新規修飾をいくつか発見した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2011-04-01 - 2014-03-31

【配分額】19,370千円 (直接経費: 14,900千円、間接経費: 4,470千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】22390313 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮体癌 / マイクロRNA / エピゲノム異常 / DNAメチル化 / 癌抑制型マイクロRNA / 癌 / ゲノム / 核酸 / microRNA / 抗癌剤感受性 / micro RNA / 癌抑制遺伝子 / がん抑制遺伝子

【研究成果の概要】

子宮体癌においてエピジェネティックな異常メチル化により発現が抑制されている癌抑制型マイクロRNA(miRNA)を同定し、その機能を解析することを目的とした。ヒト子宮体癌由来細胞株に脱メチル化剤(5-Aza-CdR)を添加し発現が増加したマイクロRNAの中からmiR-34bを同定した。miR-34bは体癌組織で発現が抑制されており、培養細胞に導入するとコロニー形成能および遊走能を低下させた。マウス移植腫瘍に対しては抗がん剤の効果を増強したことからも新たな子宮体癌治療のツールとなる可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】19,110千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 4,410千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】19350087 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

酵素化学 / 核酸 / 酵素 / 生体分子 / ゲノム / 進化

【研究成果の概要】

生命は真核生物、真正細菌、古細菌の3つに分類される。本研究では、この3つの生物界で、RNA修飾酵素の構造と機能がどう異なっているかを調べた。その結果、新たにマルチサイト特異性酵素を発見し、葉酸依存性RNAメチル化酵素のX線結晶構造解析に成功し、その触媒機構を提案し、タンパク質ノット型RNAメチル化酵素の基質RNA認識が多段階からなっていることを証明し、さらにRNA修飾ネットワークが存在することを発見した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】18,850千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 4,350千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】18750144 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム / 核酸 / 有機化学 / 高分子化学

【研究成果の概要】

本研究は、10万塩基対以上の細菌のゲノムDNAを迅速かつ高純度で化学合成することを最終目的としている。汎用されているホスホロアミダイトDNA合成では、固相担体上に一塩基ずつ鎖伸長を行い、目的のオリゴヌクレオチドを得ている。しかし、数十量体のDNAオリゴマーであれば、迅速かつ高純度で安定供給が可能であるが、数百量体のDNAオリゴマーになると鎖伸長効率やデブリネーションの問題から化学合成が困難である。そこで、安定供給できる50-100量体の合成DNAオリゴマーを縮合ブロックとし、固相担体上でフラグメント合成を行うことで、10万塩基以上のDNA鎖の合成を目指して研究を進めてきた。
まず、10量体程度のオリゴヌクレオチドの末端をホスホロアミダイト化、もしくはH-ホスホネート化することで縮合ブロックを合成し、その後、別途合成したオリゴヌクレオチドと様々な条件下で縮合反応を検討した。しかし、予期に反してその縮合反応効率は非常に低く、この縮合反応の繰り返しにより、非常に長いDNAの合成は困難であることが分かった。そこで、この縮合反応を効率よく行うために、縮合ブッロクを一本鎖DNAリガーゼを用いて連結させる反応を考案した。この時、縮合ブッロクを順序よく連結させるためには、オリゴヌクレオチドの5'位水酸基にピロリン酸結合を介しアデノシンを導入する必要がある。このアデニル化されたオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイトユニットを過剰のHOBtによって、活性化・リン酸転位反応を経て調整したリン酸化試薬を用いることで、世界で初めて、短時間に効率よく合成することに成功した。今後は、この縮合ブッロクを用いた酵素的連結反応を行い、長鎖DNAの合成を行っていく予定である。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】極限環境生物学

【研究領域課題番号】17613003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核酸 / 酵素 / 生体分子 / ゲノム / 進化 / RNA修飾 / 好熱菌 / tRNA / RNAメチル化酵素

【研究成果の概要】

本研究により、明らかとなった学術的知見は多岐にわたりますが、当初予定した三つの主要課題に照らし合わせつつ、記述すると下記のようになります。
(1)高温環境下の試験管内で、きちんと動作するRNA修飾系を組み立てる。
RNA修飾系において、RNAの構造安定化因子は(i)修飾ヌクレオシド自身(ii)RNA結合タンパク質(iii)ポリアミン(iv)塩類の4つであると思われます。細胞内における塩類濃度・組成は、ほぼ一定と予想されますので、in vitro実験系で重要な因子は、(i)〜(iii)であると思われます。
そこで、とくにポリアミンに焦点を絞り、高度好熱菌Thermus thermophilusの生産する特異的ポリアミン、カルドヘキサミンやテトラキスアミンが高温環境下でのRNA修飾に有効に作用することを見いだしました。
(2)RNAメチル化酵素の基質認識機構を生化学的に調べる。
超好熱菌Aquifex aeolicusのtRNA(m^1G37)メチル化酵素[TrmD]やtRNA(m^2_2G26)メチル化酵素[Trm1]が全く新規なRNA認識機構をもつ酵素であることや、真核生物のtRNA(m^7G46)メチル化酵素[Trm8/Trm82複合体]が真正細菌由来酵素に比較して、より厳密なRNA認識機構をもつことを見いだしました。
(3)RNAメチル化酵素の基質RNA認識がどのようなタンパク質構造によってもたらされるかを明らかにする。
TrmHに関して、保存されている塩基性アミノ酸残基に着目し、そこに変異を導入することにより、tRNAの初期結合に関する部位と触媒反応の進行に伴ってtRNAと会合する部位を明らかにすることができました。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)