【研究領域課題番号】18K06196 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム合成 / コンティグDNA / 枯草菌 / 応用微生物 / 形質転換 / 核酸 / ゲノム / バイオテクノロジー / 溶菌 / 長鎖DNA / 培養細胞

【研究成果の概要】

物理的なダメージを受けやすいサイズの大きなDNAを効率良く細胞中で合成する方法として、枯草菌を用いたプロトプラスト法による形質転換で、一度に複数のコンティグDNA断片を細胞中で連結する手法を考案した。また供与菌宿主として枯草菌を溶菌させ、溶菌液を用いて抽出・精製操作を経ずに大腸菌、出芽酵母へ導入する方法も開発できた。さらに接合伝達法についても大腸菌から真核細胞の酵母へ簡便に長鎖DNAを導入できることが実証され、自然界におけるDNAの水平伝播の原理を応用したゲノム合成法の基盤技術を開発することができた。しかし動物培養細胞への導入については未だ成功しておらず、さらなる条件検討が必要である。

【研究の社会的意義】

生物の設計図であるゲノム配列を簡単に解読できる時代に突入した。次の段階としてゲノム（長鎖DNA）を設計・合成し、細胞導入する研究が世界各国で進行している。しかしあまり認識されていないが、DNAは長くなればそれだけ物理的な衝撃に弱く扱いが難しくなる。本研究の成果は簡便に「長鎖DNAを合成する」だけでなく、合成後の「長鎖DNAを如何に目的の宿主に導入するか」を解決する上で重要な基盤技術を提供する。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】ゲノム生物学

【研究領域課題番号】15H04319 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

CRISPR / dCas9 / base-pairing / thermodynamics / melting temperature / バイオテクノロジー / 遺伝子 / 核酸 / ゲノム / RNA

【研究成果の概要】

本研究は、CRISPR法の改良による次世代型ヒト遺伝子機能解明のための基盤技術の開発を目的とした研究である。CRISPRシステムとは、原核生物の免疫防御システムを利用した新しいゲノム編集法であり、あらゆる生物種に応用可能な画期的技術として注目されている。CRISPR法では、標的部位を塩基配列で識別するガイドRNAがCas9たんぱく質と複合体を形成し、ガイドRNAが対合したゲノム領域をCas9が切断する。そのため、本研究ではゲノム切断活性を伴わないdCas9を用い、実験的手法とバイオインフォマティックスを用いた手法を組み合わせることで、ゲノム編集効率が高く実用的な手法を確立することに成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】19,110千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 4,410千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】15H02190 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNA / メチル化 / 脱メチル化 / ヒストン / 金属反応 / ペプチド合成 / エピジェネティクス / 化学合成 / イメージング / DNAメチル化 / 金属錯体 / RNA修飾 / ＤＮＡメチル化 / ＲＮＡ修飾 / 核酸 / 有機化学 / 癌 / ゲノム / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

われわれが開発した化学反応を基礎にして、高効率なエピジェネティクス検出研究を進めた。成果は次の通り。課題(i) 腫瘍不均一性を解くためのDNA反復配列に現れるメチル化の超高輝度検出、課題(ii) 腫瘍術後診断を効率化するDNA脱メチル化特異的反応生成物の超高性能分析、課題(iii) 遺伝子発現を制御するヒストン構造の化学的再現と解析

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】42,770千円 (直接経費: 32,900千円、間接経費: 9,870千円)

【研究分野】システムゲノム科学

【研究領域課題番号】26430197 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ダイレクトクローニング / 大腸菌 / 枯草菌 / 応用微生物 / 形質転換 / 核酸 / ゲノム / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

微生物間におけるDNAの水平伝播を模して、DNAを抽出・精製することなく、迅速かつ簡便に他の宿主に移行する「細胞間ダイレクトクローニング技術」の開発において、プラスミドDNAを保持する大腸菌をビルレントファージによって溶菌させ、溶菌液を直接用いて枯草菌を形質転換させる詳細な条件検討を行い、効率良くプラスミドDNAを大腸菌から枯草菌へ送り込む最適条件を確立することができた。連続的に用いることで枯草菌のゲノム中に外来のDNAを再構築させる実践的な活用法も開発した。さらに大腸菌→シアノバクテリアでも実施可能であり、汎用性の広い技術として今後広く活用されることが期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)

【研究分野】ナノマイクロシステム

【研究領域課題番号】25286035 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ゲノム / DNA / マイクロ流体デバイス / バイオテクノロジー / マイクロ・ナノデバイス / シングルセル / エピジェネティクス

【研究成果の概要】

本研究において、我々は個々の細胞から染色体/クロマチンを単離し、エピゲノム解析するための新たな手法を開発した。即ち、顕微鏡下で細胞から染色体/クロマチンを断片化させずに単離し、溶液条件を制御することで染色体/クロマチンを解きほぐしてクロマチンファイバーとし、これを展開して直線状の形態を取らせる事のできるマイクロ流体デバイスを開発した。このマイクロデバイス内では、取り出した染色体/クロマチンに対する免疫蛍光染色が可能となっている。ここで開発した手法は、個々の細胞中のゲノムに対する後天的修飾について直接調べるという1細胞エピゲノム解析への応用が期待される。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】19,760千円 (直接経費: 15,200千円、間接経費: 4,560千円)

【研究分野】応用薬理学

【研究領域課題番号】24659265 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子修正 / 遺伝性神経筋疾患 / 細胞治療 / ゲノム / 細胞 / バイオテクノロジー / DMD / 遺伝子

【研究成果の概要】

Duchenne 型筋ジストロフィー(DMD)をはじめとする単一遺伝子病に対し、遺伝子治療によるタンパク質補充療法の非臨床試験が活発に推進され効果が期待されているが、将来的には遺伝子変異そのものの修正が根本的な治療として期待される。遺伝子組み換え技術を用いた遺伝子修正療法の実用化をめざし、より高い有効性と安全性、正確性を備えたシステムの構築を検討した。また、疾患モデルにおける炎症病態を解析し、遺伝子修正細胞のプラットフォームとして間葉系幹細胞や歯髄幹細胞の応用可能性を検証した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】24390391 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子 / 医療・福祉 / ゲノム / 脳神経疾患 / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

Auditory Neuropathy (AN)は著しく言語聴取力が低い新しい難聴の病態である。本研究ではANの新たな遺伝的原因の解明を目的とした。まず36例のAN症例でサンガー法による検討をして、25例でOTOF遺伝子に11種類の新規変異を同定し、1例でGJB2遺伝子に既知変異を同定した。OTOF遺伝子変異が1アレルの4例では全ゲノムSNP解析と定量的PCR解析で大欠失を同定しなかった。上記解析で変異を同定しなかった10例では、エクソーム解析で新規AN候補遺伝子を3種類(PNPLA3、RYR3、TACC2)同定し、1家系ではOPA1に新生突然変異の可能性が高い新規変異を同定した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】応用ゲノム科学

【研究領域課題番号】23710239 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

応用微生物 / 核酸 / ゲノム / バイオテクノロジー / 形質転換

【研究成果の概要】

水平伝播を利用した次世代型クローニング技術開発に向けて、供与菌(大腸菌)と受容菌(枯草菌)の適切な培養条件を確立するとともに、安定なDNAの移行操作についての菌株の種類やヌクレアーゼ阻害剤の効果を明らかにすることができた。特にビルレントファージ(λgt10)による溶菌システムを開発したことで、プラスミドを保持する既存の大腸菌株(ライブラリー)を手軽に使用することが可能となった。さらにエキソヌクレアーゼが高効率化のための促進剤として効果的であることも判明した。以上本研究によりDNAを精製せずに簡便に他の宿主に移行させる「水平伝播を利用したクローニングシステム」の基盤技術を確立できた。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】23226016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

応用微生物 / ゲノム / 細胞・組織 / 生体機能利用 / バイオテクノロジー / 組織・細胞

【研究成果の概要】

本研究は、磁気回収が可能な新規有用物質生産微生物を創製することを大目的としている。磁性細菌の磁気微粒子合成オルガネラであるマグネトソームを再構築するための要素技術開発を行った。具体的には、下記の成果を得た。(1)磁気微粒子のサイズ・形態制御に関わるタンパク質の機能を明らかにした。(2)マグネトソームタンパク質の細胞内局在を明らかにした。(3)細菌に導入する遺伝子の組み合わせによって、磁気微粒子の形態・サイズ・数を制御する基盤技術を構築した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2011-04-01 - 2016-03-31

【配分額】209,040千円 (直接経費: 160,800千円、間接経費: 48,240千円)

【研究分野】マイクロ・ナノデバイス

【研究領域課題番号】22310080 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNA / ゲノム / ナノバイオ / マイクロ / ナノデバイス / バイオテクノロジー / マイクロ・ナノデバイス / マイクロ・ナノテバイス

【研究成果の概要】

本研究において、我々は個々の細胞からクロマチンファイバーを単離し、解析するための新たな手法を開発した。即ち、上記を実現するため、マイクロ流体デバイスおよびクロマチンファイバー操作技術を新たに開発した。ここで開発した手法は、個々の細胞中のクロマチンファイバーの後天的修飾について直接調べる手法への応用が期待される。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】19,370千円 (直接経費: 14,900千円、間接経費: 4,470千円)

【研究分野】水産化学

【研究領域課題番号】18780160 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

水産学 / 発生・分化 / バイオテクノロジー / ミオシン重鎖 / 筋肉 / ゲノム / 遺伝子発現解析 / 転写因子 / 生物・生体工学 / 小型魚類

【研究成果の概要】

メダカの筋形成過程で発現する主要なミオシン重鎖(myosin heavy chain, MYH)アイソフォームであるmMYH_<L1>、mMYH_<L2>およびmMYH_<emb1>につき、RACE法により転写開始点を同定した。次に、転写開始点から5'上流の配列をゲノムデータベースから抽出し、他生物種の相同領域とのホモロジー解析を行ったところ、mMYH_<emb1>の5'上流1kb付近にトラフグ胚体で発現するMYH_<M2528-2>の5'上流と高い相同性を示す領域が得られた。当該領域を含むmMYH_<emb1>の5'上流2kbをGFPをレポーターとするベクターに連結し、メダカ受精卵に導入したところ、メダカ胚の水平筋隔に限定したGFPの発現が観察された。同様の発現はゼブラフィッシュでも観察された。こうしたGFP陽性細胞の分布は遅筋型MYHを発現するmuscle pioneerのものと類似するが、特異抗体を用いた免疫染色の結果、GFP陽性細胞はmuscle pioneerのマーカーであるengrailedを発現しておらず、mMYH_<emb1>を発現する筋細胞の性状や発生の系譜に興味がもたれた。また、mMYH_<L1>およびmMYH_<L2>については、それぞれ翻訳開始点の5'上流2.6kbおよび4kbを連結したレポーターベクターを導入することで、メダカおよびゼブラフィッシュ胚の速筋でGFPの発現が観察された。これら結果から、MYHの5'上流には魚類の異なる筋組織での発現を制御するシス制御領域が存在することが示された。また、昨年度は筋特異的タンパク質の転写制御に関与する筋分化制御因子myoD familyをメダカからクローニングし、その発現パターンのプロファイリングを行った。今年度はこれら筋分化制御因子の活性調節に関与することがほ乳類で報告されているヒストンのアセチル化について検討した。メダカおよびゼブラフィッシュ受精卵をヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であるバロプロ酸で処理したところ、発生の遅滞や体幹部の屈曲が観察された。特異抗体を用いた組織学的解析により、これら胚では本来表皮直下に単層を形成する遅筋細胞が重層化する異常が観察された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)