【研究分野】腫瘍生物学

【研究領域課題番号】24501311 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

FAIRE-seq / シグナル伝達 / EMT / 乳がん / TGF-beta / ZEB1 / アポトーシス / ゲノム / 癌 / 転写因子 / lncRNA / lincRNA / FAIRE / RNA-seq / オープンクロマチン / TGF-β

【研究成果の概要】

本研究では乳腺上皮細胞の上皮間葉転換EMTにおける遺伝子発現変化を次世代シーケンサーを用いたRNA-seqにより解析するとともに、オープンクロマチン領域の変化につきFAIRE-seqを用いてデータ取得を行った。その結果発現変動を受けるnon coding RNAなどの新規転写産物を同定した。このうちlncRNA-Smad7の抗アポトーシス作用を見いだした。また乳腺上皮細胞に恒常活性RASを発現させTGF-βによりEMTを起こす細胞ではオープンクロマチン領域に違いが生じることを見出した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】22659159 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

心臓 / 転写因子 / インプリンティング / 心奇形 / アポトーシス / 心房利尿ホルモン / Zac-1 / Nkx2.5

【研究成果の概要】

抗アポトーシス作用を持つ新規心筋転写因子として、Zac-1遺伝子を同定した。Zac-1をCOS細胞に遺伝子導入し、抗体で染色した結果、および核分画と細胞質分画を分離し、Western blotを行った結果、この遺伝子は主として核分画に存在することが明らかになった。胎生7.5日以後のマウス胎児をwhole mount in situ hybridizationを行い、心臓領域のZac-1遺伝子の発現を観察したところ、Zac-1は胎生7.75日より発現し、胎生8日より強く発現することが明らかとなった。Zac-1遺伝子はANPプロモーターに対する転写促進活性を有していた。この転写因子がANPプロモーターのいずれの部位に結合するかを明らかにするため、ANP-Lucプラスミドのdeletion mutantを作成し、Zac-1遺伝子の結合部位を同定したところ、Zac-1は2カ所あるNkx2.5遺伝子結合部位の2個目の直前に存在することが推測された。種々の長さのZac-1の変位位体を作成し、変位体プラスミドとANP-LucプラスミドをともにCOS細胞に共遺伝子導入し、ルシフェラーゼアッセイを行ったところ、Zac-1遺伝子のいずれの部分がANPプロモーターと結合することが明らかとなった。COS細胞のNkx2.5、GATA4、MEF2Cのいずれかの遺伝子とZac-1変位体を共発現させ、共免疫沈降により、会合を確認した。既知の心臓特異的転写因子とZac-1遺伝子のANPプロモーターに対する作用を観察し、Zac-1遺伝子の心臓における転写因子としての性質を解析したところ、Zac-1とNkx2.5遺伝子は共調的に働き、ANPの転写活性を増強させた。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2010

【配分額】3,000千円 (直接経費: 3,000千円)

【研究分野】神経内科学

【研究領域課題番号】11670639 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脳虚血 / 虚血性細胞傷害 / 転写因子 / 脳保護 / 情報伝達 / CREB / オリゴデンドロサイト / 白質 / サイクリックAMP / アポトーシス / 虚血性細胞障害 / サイトカイン / IL-6

【研究成果の概要】

平成11年度から13年度にわたって、ラット中大脳動脈閉塞モデルを用い脳虚血再灌流時における、大脳白質病変と転写因子cyclic AMP response element binding Protein (CREB)のリン酸化(活性化)の関係を、オリゴデンドロサイトの特異的マーカーを用い、TUNEL染色やBcl-2蛋白発現と共に、免疫組織学的に調べた。すなわち、白質が皮質よりも大きな容積をしめるヒト脳では大脳白質が脳梗塞において主な病変部位であることが大変多く、今後の血栓溶解療法や血流再開療法の施行に伴い、白質保護が益々重要な課題になってきているからである。CREBは種々の神経栄養因子の作用発現やBcl-2蛋白などの抗アポトーシス因子発現に関与し、神経細胞の発生、分化や再生、シナプス可塑性の維持など細胞保護的に機能することが注目されている。また、CREBはthioredoxin発現を調節することで酸化ストレス抑制にも重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。実験の結果、代表的な大脳白質部位である脳梁の虚血周辺部では、再灌流24-48時間の時点で、オリゴデンドロサイト細胞核におけるCREBリン酸化の亢進の持続とともに、同細胞の細胞質でBcl-2発現は明らかに増大しかつTUNEL染色は陰性であり、Cresyl violet染色上、細胞の形態は正常に保たれていた。また、髄鞘染色上、髄鞘の密度や構造は正常に保たれていた。また、同部位のCREBリン酸化の明らかなオリゴデンドロサイトはニトロチロシン染色陰性であり、一酸化窒素やペロキシナイトライトを介した酸化ストレスを免れていた。一方、虚血中心部の脳梁では再潅流24-48時間の時点で、リン酸化CREBは全く検出されず、かつBcl-2も陰性化し、TUNEL染色は強陽性、ニトロチロシン染色陽性であり、オリゴデンドロサイトの傷害は明らかであった。また、髄鞘は明らかに非薄化していた。以上より、脳虚血再灌流時において、CREBリン酸化の持続が大脳白質のオリゴデンドロサイトや髄鞘に保護的に作用していることが明らかとなった。また、電位依存性Na^+/Ca^<2+>チャンネル阻害薬(NS-7)によって、本虚血モデルにおけるこれら細胞内情報伝達系障害が抑制され、梗塞巣が縮小化することが明らかとなり、今後の新しい治療への展望が開けてきた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】3,200千円 (直接経費: 3,200千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】09670699 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

セル・サイクル / 血管平滑筋細胞 / アポトーシス / サイクリン / 転写因子 / 抗酸化剤 / 遺伝子導入 / 動脈硬化

【研究成果の概要】

1)抗酸化剤による血管平滑筋細胞におけるアポトーシス誘導において、培養細胞の細胞密度が重要であり、細胞密度が高い時はアポトーシス誘導が困難となることを発見し、その機序として、セル・サイクルの停止が関与していることを見いだした(1998年日本循環器学会)。抗酸化剤が高密度の血管平滑筋細胞の増殖を抑制する機序について引き続き検討を重ねた結果、サイクリン依存性キナーゼのインヒビターであるp21/waf1/cip1の発現が増大していることをmRNAレベルで確認した。現在、その発現の機序を転写レベルで検討中である(投稿中)。
2)この興味ある所見にもとづき、食品中の抗酸化物質としてRed Wine Polyphenol(RW-PF)に着目し、RW-PFが血管平滑筋細胞の増殖におよぼす影響を検討した(Suntory基礎研究所との共同研究)。その結果、RW-PFは細胞密度に関わらず、血管平滑筋細胞増殖を抑制し、アポトーシスは惹起しなかった。その細胞増殖抑制作用の機序を解明するためセル・サイクル制御因子であるサイクリンAの発現を検討したところ、その遺伝子発現が、RW-PFによって転写レベルで抑制されていることが判明した(Circulation,in print)。この研究は、食品中抗酸化物質の抗動脈硬化作用のメカニズムの一部を解明するものとして重要である。
3)アポトーシス関連の核内レセプターの意義を検討する過程で、別の核内レセプターであるperoxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ)が 血管平滑筋細胞に存在し、何らかの生物活性を保持していることを確認し、報告した(Biochem Biophys Res Commun.247:353-356,1998)。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】3,000千円 (直接経費: 3,000千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07559018 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / 造血因子 / RAS / STAT / 細胞増殖 / 細胞分化 / 細胞死 / 造血 / JAK / レトロウイルス / アポトーシス / サイトカイン受容体 / JAKキナーゼ / 転写因子 / 分化

【研究成果の概要】

本研究では、IL-3/GM-CSFにより活性化される主要なシグナル経路であるRasとSTAT5の機能解析を行うとともに、それらの変異分子の作成と発現によるシグナル経路の制御法の開発を目指した。
サイトカインによる造血細胞の細胞死の抑制にRASの活性化が重要である。そこで、部分活性型RAS変異体を用いて細胞死抑制のシグナル解析を行った。その結果、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とP13キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していることを明かにした。また、サイトカイン除去により誘導される細胞死においても、FASなどによる誘導的な細胞死と同様にCaspase-3が活性化されること、さらに、それがサイトカイン除去に伴う細胞死に重要であることを示した。しかし、RASによる細胞死の抑制とCaspaseの活性との関連は現在検討中である。
IL-3/GM-CSFなどの造血因子がSTAT5を活性化することを見出していたが、そのサイトカイン機能における役割は不明であった。そこで、STAT5の標的遺伝子のクローニングを行い、SH2ドメインのみをもつ新規分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatinM(OSM)などを得た。CISはSTAT5により誘導される分子でSH2ドメインによりチロシンリン酸化された受容体などに結合してサイトカインのシグナルを抑制する負の調節分子であることを証明した。また、OSMの発現および機能の解析から、OSMは血液幹細胞が発生するaorta/gonad/mesonephros(AGM)領域での発現が認められること、AGM由来の細胞の培養系にOSMを添加することで血液の産生が著しく増加することを見い出した。さらに、この培養系では血管内皮細胞の増殖もOSMにより促進されることなどから、OSMは血管内皮と血球の共通の前駆細胞であるhemangioblastに作用する可能性が示唆された。
優勢抑制型のSTAT5変異体を作成して、STAT5の機能を検討した。IL-3依存的に増殖するBaF3細胞に優勢抑制型STAT5を発現すると、IL-3依存的な細胞増殖が有為に抑制された。この結果はSTAT5で制御されている遺伝子が細胞増殖に関与していることを示唆する。一方、赤芽球系細胞株SKT6はEPOに応答して分子しヘモグロビンを産生する。この細胞にEPO受容体の変異体および優勢抑制型のSTAT5変異体を発現することで、STAT5の活性化がEPOによる赤芽球分化において重要であることが示された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,600千円 (直接経費: 7,600千円)

【研究分野】病体医化学

【研究領域課題番号】07457580 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

癌抑制遺伝子 / Wilms腫瘍 / 細胞周期 / WT1 / G1 arrest / アポトーシス / 白血病 / M1細胞 / サイクリン / CDK / 転写因子 / 転写制御

【研究成果の概要】

これまでに、Wilms腫瘍の癌抑制遺伝子WT1の産物が転写因子で過剰発現すると細胞周期のG1期からS期への移行を抑制する活性をもつことを明らかにした。さらに急性白血病の症例ではWT1が発現しており、その発現レベルと予後が逆相関すること、急性白血病由来細胞株K5632の分化を誘導するとWT1の発現が低下し検出されなくなること、WT1のantisense oligonucleotideがK562細胞やAML患者由来細胞の増殖を抑制することが明らかになった。これらの結果から、白血病細胞ではWT1の発現が増殖にpositiveに作用している可能性があると考え、WT1を発現していないM1細胞にinducibleにWT1を発現させその増殖に及ぼす効果を検討した。その結果WT1を発現させるとM1細胞はG1 arrestとapoptosisを起こすことが見出された。したがって、WT1の作用は細胞の種類により異なり、単純に一般化はできないと考えられた。さらに他の細胞系を用いると、はじめに述べたようにNIH3T3細胞ではG1 arrestのみをおこし、F9細胞ではレチノイン酸で分化を誘導するときにのみapoptosisを起こすという異なった効果が観察された。いずれにしても、WT1はG1 arrestのみでなくapoptosisを起こす活性もあることが明らかになった。さらにWT1の機能を明らかにすることを目的としてWT1の作用によって発現の誘導される遺伝子をサブトラクション法による単離を開始した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1995 - 1996

【配分額】1,800千円 (直接経費: 1,800千円)