【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】23791811 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

SIRT1 / DBC-1 / アポトーシス / カスパーゼ / E-cadherin / 子宮内膜 / 子宮体癌 / 細胞接着能 / レズベラトロール / sirtinol / 子宮体癌細胞株

【研究成果の概要】

我々は長寿関連遺伝子SIRT1と、それを制御している乳癌関連遺伝子DBC?1のアポトーシスにおける機能解析を行った。また子宮内膜におけるSIRT1の機能解析を行った。
DBC?1はアポトーシスを誘導すると、カスパーゼ?7に分解されることが確認された。またSIRT1はアポトーシス誘導時にDBC?1と共に核から核外に局在が移行し、アポトーシスを更に増加させる可能性が示された。
子宮内膜においてSIRT1が細胞接着調節因子であるE-cadherinの発現を正に調節し、細胞接着能を増加させる可能性が示された。また子宮内膜における発癌、胚における子宮内膜接着能にSIRT1が関連している可能性がある。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】20249060 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生体イメージング / 光イメージング / 発光 / caspase-3 / アポトーシス / 分子機能 / 抗体診断・治療 / ライブ診断 / 発光イメージング / 光プローブ / ストレスイメージング / カスパーゼ / トランスジェニックマウス / 肝腫瘍 / 抗体診断 / Dlk-1

【研究成果の概要】

本研究では、以下のふたつのテーマに関して、研究を行なった。
テーマA:小動物モデルをもちいて種々の病変に対する質的診断、薬剤感受性の検討を目的とした生体イメージング法の開発: luciferase-baseの新規機能プローブ開発によるin vivo imaging。Luciferase をbase としてCaspase-3に対する活性化プローブを作製し、それをアデノウィルスベクターに導入した。このベクターをもちいて様々な細胞、マウス肝臓に遺伝子導入を行ない、細胞レベルおよびマウス実験を行なうことにより、caspase-3 活性(アポトーシス)の生体イメージングに成功した。特に、低酸素・再酸素化、虚血・再灌流時および肝臓切除後再生時に起こる酸化ストレスとアポトーシスの動的解析に成功した。
テーマB:腫瘍特異的抗体への発光・蛍光ドットデュアルプローブの搭載による新しい診断・治療法の確立(術中診断を含め): in vivo/ex vivo imaging。様々な癌細胞抗原(Dlk-1/CEA/EMA/Ep-CAM)に対する抗体を用意し、それらに対して我々が独自に開発した上記光プローブを搭載した。種々の癌細胞におけるこれらの抗原の発現をFACS/Western Blotにて確認した後、ヌードマウスへの移植実験を行ない、モデルを作製した。Dlk-1抗原を発現する肝細胞癌移植実験モデルをもちいて(マウス皮下および肝内)、開発したプローブの有用性を確認した。マウスにおける実験で、紫外線などの照射を必要とせず、基質投与のみで近赤外領域の長波長のシグナルを腫瘍から発することが確認され、また深部病変の検出にも有用である可能性が示唆された。現在他の抗原に対するイメージング実験を行なっている。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】49,010千円 (直接経費: 37,700千円、間接経費: 11,310千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】19592159 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ3 / 破骨細胞 / アポトーシス / 骨吸収 / 下顎前突症 / カスパーゼ / Caspase3 / 骨 / リモデリング / ミトコンドリア

【研究成果の概要】

アポトーシスとは、細胞の縮小や断片化、核の凝集と断片化といった形態的な特長を呈するあらかじめプログラムされた細胞死のことで、様々な分子間のシグナル伝達によるコントロールを受けている。そのなかでも、カスパーゼ3はシステインプロテアーゼの一種で、刺激により活性化されると、PARP(ADP-リボースポリメラーゼ)をはじめとするさまざまな細胞内基質を分解し、アポトーシスを誘導すると考えられている。骨形成を担う骨芽細胞は、骨細胞となり骨内に埋め込まれる際にその半数はアポトーシスすると考えられている。また、破骨細胞も骨吸収終了後に骨面から離れアポトーシスすることが示されている。骨系細胞のアポトーシスは骨組織における重要な代謝機構のひとつと考えられ、その調節を担うカスパーゼ3は何らかの関与をする可能性がある。そこで今回、カスパーゼ3遺伝子欠損マウスを用い、その役割を検索した。8週齢マウス頭蓋骨について肉眼観察及びX線撮影を行ったところ、遺伝子欠損型マウスの頭蓋冠はドーム状を呈し、眼耳平面と後頭蓋底前後径との交線は野生型に比べて鈍角となり、頭蓋の成長抑制が認められた。さらに、遺伝子欠損型では加齢に伴い頭蓋骨の膜性骨化の亢進と下顎前突症の所見が認められた。新生仔脛骨を通法に従い固定、脱灰後,パラフィン包埋による組織切片とし、TRAP染色を施したのち、顕微鏡にて破骨細胞の数を計測したところ、遺伝子欠損型では破骨細胞数の減少が認められた。この減少が骨芽細胞からの支持能減少に伴うものかどうかを検討するためにカルバリアより骨芽細胞を調整し、OPG mRNAの発現を検討した。遺伝子欠損型の骨芽細胞では野生型に比べ培養開始から、その発現量の増加が見られた。また遺伝子欠損型骨芽細胞のin vitroにおける石灰化亢進も認められた。アポトーシスを制御するカスパーゼ3の遺伝子欠損マウスでは、石灰化亢進を伴う頭蓋形成異常と、成熟破骨細胞数の減少を認めた。これらのことから、カスパーゼ3遺伝子は、骨芽細胞と破骨細胞のアポトーシス制御という面から、骨形成と骨吸収の微妙なバランスを保ち、正常な頭蓋の成長発育などを調整していることが示された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】15100007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ / ショウジョバエ / 遺伝学 / 神経発生 / IAPファミリー / イメージング / キナーゼ / プロテアソーム / 神経細胞死 / ショウジョウバエ / 神経変性 / タンパク質分解 / アポトーシス / JNK / 蛋白質分解 / 神経細胞 / 細胞死 / 発生 / マウス / 細胞選択

【研究成果の概要】

ショウジョウバエ遺伝子の過剰発現スクリーニング(GSスクリーニング)を取り入れることで、神経細胞死シグナルの機能的的ゲノムスクリーニングを行った。ポリグルタミンによる神経細変性に関与する遺伝子として小胞体に存在する不良品蛋白質の輸送チャネル(Sec61α)を同定した。Sec61αは、分泌経路で合成される蛋白質の小胞体への移行と、小胞体関連タンパク質分解Endoplasmic Reticulum Associated Degradation : ERADにおいて小胞体から細胞質への不良品タンパク質の輸送を担う重要なチャネルである。Sec61αをショウジョウバエ複眼や培養細胞で過剰発現すると不良品タンパク質が細胞質に逆輸送されて蓄積し細胞死が誘導されること、逆にSec61αの活性を遺伝学的に弱めることによりポリグルタミン病モデルにおいて細胞質に蓄積していた不良品タンパク質が減少し、晩発性の神経変性が回復することが明らかになった。さらに、GSスクリーニングによって、神経細胞死シグナルを発する候補遺伝子としてDmIKKεが得られた。遺伝子の機能欠損スクリーニングによってもDmIKKεが得られ、細胞死を誘導しないレベルのカスパーゼ活性を調節することを見いだした。細胞死シグナルに関与する遺伝子のスクリーニングからDmIKKεが得られたことをふまえてその基質を探索した結果、種を超えて保存されたカスパーゼ抑制因子DIAP1が同定された。DmIKKεはDIAP1をリン酸化することによってその分解を促進する。DmIKKεを生体でノックダウンすると内在性のDIAP1レベルが組織で上昇した。しかし、この状態でも発生過程での細胞死は正常におこり、ここでのDmIKKεによるDIAP1レベルの調節は細胞死以外の生理機能に関与することが示唆された。本研究が明らかにした段階的なカスパーゼ活性化による神経選択の新たな仕組みは、発生と神経変性での細胞運命決定機構に新たな視点をもたらしたものである。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2003 - 2006

【配分額】119,080千円 (直接経費: 91,600千円、間接経費: 27,480千円)

【研究分野】放射線科学

【研究領域課題番号】15790654 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

JNK / Caspase / p52 / c-Jun / ストレス応答 / アポトーシス / カスパーゼ

【研究成果の概要】

私は、希薄なサンプルを泳動し分解能を上げることにより、放射線によって誘導されるJNKタンパク質をWestern解析により見出した。この放射線によって誘導されるJNKタンパク質(分子量50kDa)は、恒常的に発現している既知のJNKタンパク質(46kDa,54kDa)とは異なる分子量を示すこと、JNKリン酸化特異的抗体によって認識されない非リン酸化型フォームであること、JNKタンパク質の全長を認識するポリクローナル抗体では検出されるが、C端を認識するモノクローナル抗体では検出されないことから、これまで報告のない新しいJNKフォームであることが示唆された。またこの誘導型JNKは、放射線誘発細胞死を起こした細胞で見られることから、細胞死の誘導との関連が示唆された。そこで、アポトーシスにおいて実効的な役割を担うシステインプロテアーゼの1つであるカスパーゼの阻害剤を用いて、p52発現誘導における影響を調べた。その結果、caspase-1,-4の阻害剤であるYVAD-CHOでは、X線照射後のp52発現誘導を抑制できなかったが、caspase-3,7の阻害剤であるDEVD-CHOでは、p52の発現とp54の発現量減少が完全に抑制された。さらにin vitroにおいて、リコンビナンドp54JNK1,P54JNK2はactive caspase-3によって切断されることが判明した。以上の結果からX線や温熱によってアポトーシスを起こす細胞にみられるp52JNKの誘導はp54JNKがカスパーゼによって切断された切断産物である。カスパーゼは哺乳類細胞では、14種類以上存在することがわかっている。先の結果からDEVD-CHOに感受性のあるカスパーゼcaspase-3,-7は基質タンパク質内のDXXDという配列を認識し、基質を切断する。しかしながらp54JNKのアミノ酸配列内にDXXD配列は存在しないことがわかったため、C端側に存在するatypicalな配列であるSDTDという配列に着目した。この配列のP1ポディションのDをAに置換した変異体を構築し、活性型caspase-3と反応させたところ、切断は抑制された。さらに切断型JNK(p52)の細胞内局在と機能をかいせきするため、p52発現ベクターを構築し、ヒト胎児腎細胞(293T)に導入した。その結果、P52の細胞内局在は、既知のJNKと変わらないこと、P52発現による放射線感受性の変化は無いことが判明した。In Vitroの実験でもp52のc-Junリン酸化能に変化は認められなかった。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】14657580 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNAトポイソメラーゼ / 遺伝子ノックアウトマウス / マウス初期胚 / ICRF-193 / RNAi / アポトーシス / カスパーゼ / HeLa細胞

【研究成果の概要】

研究代表者らが作出したDNAトポイソメラーゼIIα遺伝子ノックアウトマウスは、4細胞期で発生を停止するという表現型を示した。さらに、発生を停止した遺伝子ノックアウトマウス胚においては、見かけ上ふたつに分裂した核球の染色体DNAが、細いフィラメント構造により連結した形態をとっている。これらの発生停止胚は、抗PCNA抗体染色陽性で、かつ抗リン酸化ヒストン抗体染色陰性であった。DNAトポイソメラーゼIIαの阻害剤であるICRF-193で野生型胚を処理した場合にも発生が停止し、核球の形態異常がみられ、細胞は抗PCNA抗体染色陽性かつ抗リン酸化ヒストン抗体染色陰性であった。さらに、RNAi法によりHeLa細胞のDNAトポイソメラーゼIIαのメッセンジャーRNAを中和した場合にも、初期胚でみられたと同様の核の形態異常が認められた。これらの結果は、DNAトポイソメラーゼIIαの活性低下が生じると、G2期における染色体DNAの分離過程に異常が生じ、嬢染色体が完全に分離していないにもかかわらず細胞質分裂が進行してしまうことを示唆している。すなわち、このような状態における細胞においては、従来知られている細胞周期のチェックポイント機構は作動しないと考えられる。
さらに研究代表者らは、DNAトポイソメラーゼIIα遺伝子ノックアウトマウス胚、ICRF-193処理により発生を停止したマウスの初期胚、並びに、RNAiにより核の異常形態を引き起こしたHeLa細胞がアポトーシスを誘導することを見いだした。染色体分離異常を細胞がモニターし、カスパーゼ経路の活性化が引き起こされると考えられる。このアポトーシス誘導機構は、チェックポイント機構では排除しきれない異常細胞を個体から除去するために必要であると思われる。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2002

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】胸部外科学

【研究領域課題番号】14571276 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Caspase / Diazoxide / apoptosis / アスパラギン酸 / 遅発対麻痺 / 実験モデル / 脊髄保護 / アスパラギン酸虚血下分節注入モデル / Amyotrophic lateral sclerosis / Caspase inhibitor / AMPA / kainate受容体 / 胸腹部大動脈瘤 / 対麻痺

【研究成果の概要】

従来、in vivoではreuptake activityにmaskされてしまうためexcitatory neurotoxicityに特異性の高い実験動物モデルが乏しく、その有効性や作用機序を解明することが困難であった。独自に脊髄をそれ自体では障害を与えない程度の短時間虚血にしながら、アスパラギン酸を分節注入することにより、対麻痺を作成するという新しい実験動物モデルを開発した。このモデルでcaspase inhibitorであるdiazoxideとMK-801、riluzoleとの併用のaspartate neurotoxicityにたいする脊髄保護の有効性を評価した。New Zealand white rabbitを用い,A群(n=7)では,diazoxide(4mg/kg)を術前に静脈投与した.B群(n=7)はdiazoxide(4mg/kg)とNMDA受容体阻害薬MK-801(6mg/kg)を投与した.C群(n=7)はriluzoleを術前10日間(100mg/kg/day)経口投与させたのち、diazoxide(4mg/kg)を投与した.D群は、controlとして、溶解液のみ注入した。カテーテルを右大腿動脈から腹部大動脈にむけ挿入、先端をbifurcationから5mm上の位置に固定した。腹部大動脈を左腎静脈直下とbifurcationで血流を遮断した状態で、30mMのアスパラギン酸溶液を2ml/minの速度で10分間カテーテルから注入した。手術後、神経学的所見をTarlovのmodified scoreに従い、12、24、48時間後、評価した。Tarlov scoreは、A群で3.8±0.9,B群は3.4±0.6,C群は4.0±0.6,D群は0.8±0.6とA群でD群より有意に良好な回復を示した(p<0.05)。A群とB群、C群の各群間に有意差は認めなかった。病理組織学的検索では、D群では、灰白質の神経細胞の脱落および白質の障害が著明であったが、A群、B群、C群とも灰白質の軽度のeosinophilic changeのみであった。アスパラギン酸虚血下分節注入による脊髄障害にたいしdiazoxideは有効だがNMDA受容体阻害薬、riluzoleとの併用効果は認めなかった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】2,900千円 (直接経費: 2,900千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】13470357 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

in vitro / 支持細胞 / アポトーシス / カスパーゼ子 / Math 1 / 遺伝子治療 / ガスパーゼ子 / Math1 / カスパーゼ

【研究成果の概要】

1)主にアデノウィルスベクターを用いてモルモット内耳に遺伝子導入を行った。内リンパ嚢経由や蝸牛中央階投与でコルチ器に遺伝子発現が得られた。また新たに確立した内耳whole mount培養法では蝸牛・前庭・半規管ともに有毛細胞・支持細胞に遺伝子発現できた。蝸牛窓経由の侵襲の低い遺伝子投与法も開発した。
2)アデノウィルスベクター反復投与による免疫反応から生じる内耳毒性は副腎皮質ホルモン投与で予防できることを示した。
3)Math1遺伝子組み込みアデノウィルスベクターをモルモット蝸牛に投与することで蝸牛支持細胞から有毛細胞への変化が得られた。この細胞に向かって神経線維が伸びていくことも観察した。
4)カナマイシンとエタクリン酸でモルモットを聾にし、BrdUを連日投与してその取り込みを調べた。薬剤投与後3日目から蝸牛コルチ器内にBrdUの取り込みがみられ、3-5日目が最も取り込みが多いことが判明した。このBrdU陽性細胞の三分の一は明らかに分裂しており、免疫組織化学の検討でダイテルス細胞であることが示された。また透過電顕での観察でアポトーシスの所見がなく、1ヵ月後も観察できることから、この細胞は死にゆく細胞では無いことを確認した。
3)4)の結果は大きなbreak throughであり、支持細胞増殖能亢進が得られればMath1遺伝子治療との併用などで、多数の有毛細胞再生が得られる日も近いと思われる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】10,000千円 (直接経費: 10,000千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】11557177 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞性粘菌 / 分化誘導因子 / DIF-1 / カルシウム / カルシニューリン / 抗腫瘍因子 / 白血病細胞 / アポトーシス / インシュリン / Insulinoma細胞 / カスパーゼ / 抗ウイルス作用 / 抗腫瘍作用 / DIF / Xenopus laevis / 卵母細胞 / cAMP / Jarkat細胞 / Jac / Statシグナル伝達 / protein kinaseB

【研究成果の概要】

1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)-1-hexanone(DIF-1)は細胞性粘菌D. discoidedeumの柄細胞分化誘導因子である。DIF-1は哺乳動物細胞に対して増殖抑制、分化誘導などの生理的作用を有する。この作用が起こる早い時期に細胞内カルシウムの上昇することが知られている。今回の研究では先ず、カルシウムイオンとの関連からDIF-1のレセプターの一つと考えられるカルシニューリン(CaN)に注目して、CaNへのDIFアナログの作用を解析した。DIF-1とDIF-2は低濃度(10-30nM)では直接カルシニューリンを活性化した。また高濃度(10-30μM)では阻害することを見いだした。またヒト白血病細胞K562細胞Akt/protein kinase Bの活性をDIF-1処理後を追跡したところ、30分から6時間にわたって経時的な活性化が見られた。そしてこの活性化には細胞内カルシウム濃度の増加が必要であった。インシュリンを分泌するinsulinoma細胞(INS-1)に対して、DIF-1は用量依存的に細胞死を惹起した。このアポトーシスはDIF-1はcaspase independent apoptosisであることを明らかにした。DIF-1が抗腫瘍作用ばかりでなく、in vitroでinfluenza virus A/PR/8/34の増殖を抑制することを明らかにした。しかし真菌(C. albicans, C. neoformas, A. fumigatus)や細菌(S. aureus, E. coil, P. aeruginosa)には作用しないことを見いだした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】6,700千円 (直接経費: 6,700千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09780648 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ / ショウジョウバエ / 細胞死 / 線虫 / アポトーシス / プロテアーゼ / ICE / Bcl-2 / 酵母

【研究成果の概要】

CED-4はcaspaseの活性化因子として細胞死の実行に深く関与している。CED-4の機能解析を生化学的・分子遺伝学的に行うことを目的としてショウジョウバエを用いたCED-4の機能評価系を確立した。ショウジョウバエ由来の培養細胞であるS2にCED-4を過剰に発現させることによってcaspaseの活性化を伴う細胞死を誘導することが出来た。CED-4によって活性化されるcaspaseをaffinitylabelによって同定した結果、dr ICEが活性化されていることが明らかになった。免疫沈降実験によって細胞内ではCED-4とdr ICEが複合体を形成することが明らかになり、caspaseとの直接の相互作用がその活性化に必要であることが示唆された。また、CED-4内のP-loop motifがcaspaseの活性化に重要であり、P-loopmutationはdominant negativeにCED-4による細胞死を抑制した。ショウジョウバエ複眼に過剰発現させたCED-4はcaspaseの活性化を伴った細胞死を誘導し、生体でのCED-4の機能を評価する系が確立された。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】09877242 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大腸癌 / Apoptosis / Bcl-2 / Bax / p53 / Caspase / アポトーシス / テロメラーゼ

【研究成果の概要】

悪性腫瘍では、細胞増殖と細胞死のバランスが破綻し無秩序な細胞増殖が生じている。大腸癌におけるApoptosisの異常を明らかにする目的でApoptosis関連遺伝子の発現を解析した。大腸癌切除例、ヒト大腸癌細胞株を対象として、Apoptosis抑制因子Bcl-2、Bcl-XL,Apoptosis促進因子Bax、Bad、Bak、Apoptosis EffectorであるCaspase Family(ICE、CPP32、ICH-1L)、さらに、癌抑制遺伝子p53の発現をWestern Blottingで解析し、Densitometerを用いて定量化、癌部分と正常粘膜のそれぞれの発現を比較した。すべての症例において、Bax、Bad、Bak、CPP32、ICH-1Lは癌、正常粘膜の胃方に発現が認められた。Bcl-XL.Bax.Bad.CPP32、ICH-1L、p53は、正常粘膜に比較して癌で発現が高い傾向が認められた。逆に、Bcl-2、Bak、ICEは、癌に比較して正常粘膜で発現が高い傾向が認められた。個々のの腫瘍における各Apoptosis関連遺伝子の発現パターンは多様であるが、高頻度に認められた顕著な変化は,癌におけるBcl-XLの発現上昇、Bcl-2の発現減少であった。各々の因子の間に朗らかな相関は認められなかった。
大腸癌におけるApoptosisの抑制には、Bcl-XLの過剰発現、Bakの発現低下が関与している可能性が示唆された。特に、Bcl-XLの発現上昇は、大腸癌の発生に重要な役割を果たしている可能性が考えられる。癌で認められたApoptosis促進因子Bax、Badの発現上昇、Apoptosis Effector CPP32、ICH-1Lの発現上昇は、生体反応として、癌細胞を排除するためのApoptosis誘導機構も活性化されている可能性を示唆するものと考えられる。個々の腫瘍で異なる、Apoptosis関連遺伝子の発現異常は個々の腫瘍の生物学的性質の多様性を反映している可能性が考えられる。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)