【研究分野】呼吸器内科学

【研究領域課題番号】15590799 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

COPD / 遺伝子治療 / Glutathione S-transferase P1 / Klotho遺伝子 / 慢性喫煙 / アデノウイルスベクター / アポトーシス / 慢性閉塞性肺疾患(COPD) / 肺気腫 / グルタチオンSトランスフェラーゼ

【研究成果の概要】

Glutathione S-transferase P1 (GSTP1)はGSTのサブタイプ一つで、毒性物質に対するグルタチオン抱合を触媒する。Glutathione (GSH)は哺乳動物において最も豊富な細胞内抗酸化物質であり、多くの酵素機能や免疫能の維持に必須の重要な蛋白質である。GSTP1は、このGSHの代謝に関わるわけではなく、GSHの酵素機能の調節に主に関わっている。GSTP1は肺胞、肺胞マクロファージや呼吸細気管支において他のGSTよりもより強く発現していることが報告されており、肺気腫が形成される末梢気道において重要な役割を果たしている可能性がある。そこで、GSTP1についてCOPDとのassociation studyを行ったところ、exon-5における105Ile genotypeとCOPDとの関連が示唆された。このGSTP1遺伝子多型のCOPD発症への意義を確立するためには、本来ならば、この遺伝子多型毎に喫煙負荷量をマッチさせた群を前向きに、呼吸機能などで評価追跡すべきである。しかし、病的な気流閉塞を証明するためには喫煙を続けても20年以上の経過観察が必要であり、実際的ではない。そこで、GSTP1蛋白機能のない個体を用いて喫煙負荷研究を行うため、英国で開発されたグルタチオンS-トランスフェラーゼP1/P2(GSTP1/P2)欠損マウスを移入した。マウスのGSTPは、GSTP1、GSTP2がクローニングされており、両者は2.5kb間隔でタンデムに位置している。GSTP1を欠失させ、GSTP2をtruncatedしたコンストラクトを作成し、ES細胞に遺伝子導入し、両遺伝子の発現がES細胞中に見られないことを確認し、マウスを作成した。
マウスのGSTPはGSTP1遺伝子発現がGSTP2発現量をはるかに上回るため、両者を欠失させた場合その影響は、主にGSTP1遺伝子発現がないものと考えてよい。本研究では、GSTP1/P2 null mouseに対する喫煙肺障害を検討した。その結果、慢性喫煙負荷によってGSTP1/P21 null mouseは肺気腫様の変化を生ずることが明らかとなった。したがって、ヒト個体における喫煙後の肺気腫形成のよいモデル動物と考えられ、同時にCOPD患者の病態研究に重要な情報を提供しえるものと考えられる。COPDには、慢性気管支炎、肺気腫があり、この2病型は肺組織の形態も病理も異なっている。加齢は万人に生ずるが、その結果生ずる老化というヘテロな病態に修飾されるCOPDは、遺伝的素因もさることながら、その後の病気を悪化せずに食い止める手立てがより重要であると考えられる。したがって、肺機能の悪化の早い患者群や、気管支拡張薬が奏効する患者群を選び出すような遺伝的解析が重要である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】脳神経外科学

【研究領域課題番号】13770775 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

悪性神経膠腫 / 遺伝子治療 / ハイブリッドベクター / アデノウイルス / レトロウイルス / アデノ随伴ウイルス / HSV-tk / アポトーシス / Bim

【研究成果の概要】

悪性神経膠腫をはじめとする脳腫瘍の遺伝子治療に適したベクターの開発を目標として、異種のウイルスのハイブリッドを応用した治療ベクターの開発を推進した。(1)悪性神経膠腫における自殺遺伝子治療の効果を高めるため、細胞内で治療ベクターを産生させるアデノ-レトロハイブリッドの治療効果を検討した。HSV-tk発現レトロウイルスベクターのゲノムを有するハイブリッドウイルスを用い、従来得られたin vitroにおける感染実験の結果を参考にマウス皮下腫瘍モデルにて、レトロウイルスベクターを誘導しGCVを腹腔内投与すると、抗腫瘍効果の増強が確認された。また、腫瘍細胞内の治療ベクターのコピー数が約170倍以上増加し、In situ hybridizationにおいて治療遺伝子の発現がより広範に認められた。また、治療遺伝子の効果を高める工夫として、BH3因子とHSV-tkとの相乗効果を確認した。(2)頭蓋内における遺伝子導入においては、より安全性の高いベクターの開発が将来期待される。このため、炎症反応を起こしにくいAAVベクターの悪性脳腫瘍への応用を検討した。各種の神経膠腫細胞株を用いてeGFPを発現する1-5型のAAVベクターの感染様式を比較した結果、2型での発現が高い群、2および5型での発現が高い群、および5型での発現が高い群の3種類に分類された。E1B55kを欠失し腫瘍において優位にウイルスを増幅させるAAVベクターAAVE1、HSV-tkおよびRepを発現するAAVベクターAAVTRや、Capを発現するアデノウイルスベクターAVCapを構築した。AAVTRを、AAVE1、AVCapと共に神経膠腫細胞に感染させ、腫瘍細胞内でのAAVTRの増幅を確認した。動物モデルにおいて感染条件と副反応を詳細に検討することにより、この技術を応用した治療システムの開発が期待される。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】1,900千円 (直接経費: 1,900千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】13470357 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

in vitro / 支持細胞 / アポトーシス / カスパーゼ子 / Math 1 / 遺伝子治療 / ガスパーゼ子 / Math1 / カスパーゼ

【研究成果の概要】

1)主にアデノウィルスベクターを用いてモルモット内耳に遺伝子導入を行った。内リンパ嚢経由や蝸牛中央階投与でコルチ器に遺伝子発現が得られた。また新たに確立した内耳whole mount培養法では蝸牛・前庭・半規管ともに有毛細胞・支持細胞に遺伝子発現できた。蝸牛窓経由の侵襲の低い遺伝子投与法も開発した。
2)アデノウィルスベクター反復投与による免疫反応から生じる内耳毒性は副腎皮質ホルモン投与で予防できることを示した。
3)Math1遺伝子組み込みアデノウィルスベクターをモルモット蝸牛に投与することで蝸牛支持細胞から有毛細胞への変化が得られた。この細胞に向かって神経線維が伸びていくことも観察した。
4)カナマイシンとエタクリン酸でモルモットを聾にし、BrdUを連日投与してその取り込みを調べた。薬剤投与後3日目から蝸牛コルチ器内にBrdUの取り込みがみられ、3-5日目が最も取り込みが多いことが判明した。このBrdU陽性細胞の三分の一は明らかに分裂しており、免疫組織化学の検討でダイテルス細胞であることが示された。また透過電顕での観察でアポトーシスの所見がなく、1ヵ月後も観察できることから、この細胞は死にゆく細胞では無いことを確認した。
3)4)の結果は大きなbreak throughであり、支持細胞増殖能亢進が得られればMath1遺伝子治療との併用などで、多数の有毛細胞再生が得られる日も近いと思われる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】10,000千円 (直接経費: 10,000千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】12470149 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

LIF / 心筋梗塞 / プラスミド / 心臓リモデリング / VEGF / GFP / 骨格筋 / 共培養 / アポトーシス / 血管新生 / 骨髄細胞 / 遺伝子治療 / 幹細胞 / 心筋細胞 / 骨格筋細胞 / ANP / GATA / 心不全 / 心筋細胞分化 / BMP / TAK / Smad / ATF-2

【研究成果の概要】

leukemia inhibitory factor(LIF)の心臓に対する作用をマウスの心筋梗塞モデルを用いて検討した。心筋梗塞後のマウスの下肢にLIFのプラスミドを筋肉内注射したところ、2日後より血液中のLIF濃度は増加し、その後4週間後まで持続した。心筋梗塞を作成してから2週間後に心臓を評価した。LIFプラスミド注射群(LIF群)ではコントロール群に比べ、心筋梗塞後の心機能の低下や心臓リモデリングは軽減していた。梗塞境界領域での心筋細胞のアポトーシス数もコントロール群に比べLIF群で減少していた。LIF群ではVEGFの発現の亢進と血管内皮細胞の増加が認められたことより、LIFによる血管新生が心筋細胞のアポトーシスを減少させている可能性が示唆された。増殖している細胞の核で発現するKi-67蛋白の抗体で免疫染色をおこなったところ、LIF群では梗塞境界領域でKi-67陽性の心筋細胞が認められた。次にGFPトランスジェニックマウスの骨髄細胞を野生型マウスに移植し心筋梗塞を作成して解析をおこなった。LIF群ではコントロール群に比べ2週間後の梗塞境界領域におけるGFP陽性細胞数が増加していた。さらにこのGFP陽性細胞が心筋細胞や血管内皮細胞であることを確認した。今回の研究でウイルスベクターを使わなくとも、プラスミドの筋肉内注射のみで有効な治療効果が得られることも明らかとなった。
骨格筋内に心筋細胞へ分化可能な細胞が存在するか否かを検討するため、GFPを過剰発現するマウスの骨格筋由来細胞を単離し、1)新生仔ラットの心筋細胞と共培養、2)骨格筋由来細胞の単独培養、3)心筋細胞と培養液のみ共有するdouble chamber法による共培養、の3通りの方法で培養した。培養5日後に免疫細胞染色法により心筋特異的トロポニン、ANP、GATA4、cadherin、connexin43の発現を比較検討した。その結果、両者の細胞が互いに接することが可能な共培養下においてのみGFP陽性細胞の一部にトロポニン、ANP、GATA4の発現が認められた。また骨格筋由来細胞と心筋細胞との細胞間接着部位にcadherinとconnexin43の発現が認められた。これらの結果から骨格筋内に心筋細胞に分化可能な細胞が存在することが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】11877291 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

培養 / 内耳 / 再生 / 遺伝子治療 / 有毛細胞 / Cochlea / hair cell / apoptosis / GDNF / gene therapy

【研究成果の概要】

成熟モルモットを麻酔・消毒後、滅菌操作で断頭し、側頭骨を摘出、実態顕微鏡下に蝸牛と前庭に分け、CO2インキュベーターに入れて培養した。その後1日-7日間培養し、固定してsurface preparationおよび透過電顕にて観察した。蝸牛においては培養2-3日以内に有毛細胞は死滅し、支持細胞も変性した。ただし、1-2日目の透過電顕の所見ではscar formationが見られ、一部支持細胞表面に有毛のような構造が見られた。前庭では有毛細胞の変性は蝸牛より遅く7日間の培養でも正常に近く保たれた。蝸牛・前庭どちらにおいても神経線維の脱落が培養初期より認められた。はじめはfree radical scavenger等の投与により有毛細胞死の防御を予定していたが、すでに同様の実験での報告がなされたため、この実験系を用いて遺伝子導入が可能か検討した。LacZ遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクターを投与し、その発現を見たところ、蝸牛ではmesothelial cell以外に血管条、ラセン神経節、Deiters cellやpillar cellなどの支持細胞、外有毛細胞にLacZ遺伝子の発現が見られた。前庭では有毛細胞および支持細胞にLacZ遺伝子の発現が見られた。今後は神経賦活因子や再生関連遺伝子を組み込んだベクターの投与を行なう予定である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】1,800千円 (直接経費: 1,800千円)