【研究分野】食品科学

【研究領域課題番号】20780090 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アクアポリン / 水チャネル / 嚢胞症 / 組織化学 / 小胞体ストレス / 細胞増殖 / アポトーシス / AQP11

【研究成果の概要】

細胞内局在型水チャネルであるアクアポリン11(AQP11)遺伝子の欠損マウスの腎臓、胃、小腸、肝臓、脾臓の表現型の解析を行った。その結果、AQP11欠損マウスでは腎臓における嚢胞形成以外には顕著な形態変化が無いことが明らかになった。AQP11欠損マウスの嚢胞形成時の腎臓においては発現遺伝子の約20%に発現量変化が起こっていることを明らかにし、さらに、その遺伝子プロファイル解析から嚢胞形成の機構を解明した。これらの解析から、AQP11の生理機能の一端を明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】17390357 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝再生 / シグナル伝達 / 細胞増殖 / 細胞成長 / アポトーシス / 分子標的治療 / 脂肪肝 / 加齢 / 肝細胞内シグナル

【研究成果の概要】

正常肝のみならず脂肪肝の肝切除あるいは加齢肝切除といった種々のマウス疾患モデルに関して、肝再生の開始、維持、終止の分子機序を細胞内シグナルの役割の観点から解析した。
正常肝の再生に関しては、細胞内シグナルJak/STAT3経路およびPI3-K/PDK1/Akt経路を中心に解析し、肝の物理的再生および機能的再生における「細胞成長」の重要性を確認・研究した。分子機序の解析には、STAT3、PDK1の肝特異的ノックアウトマウスおよびそれらのダブルノックアウトマウスを作成し、30%および70%肝切除を行い、細胞内シグナル伝達機構を解析した。必要に応じてアデノウィルスベクターによる種々の遺伝子導入によりシグナル分子機能を制御した後機能解析をした。「細胞増殖」に関しては、mitotic index、BrdUの取り込み、PCNAの発現、Cyclin-A/D/E、CDKの活性化、実際の細胞分裂像の変化を定量的かつ経時的なダイナミズムを解析し、「細胞成長」に関しては、組織切片から、あるいは電子顕微鏡写真をもちいてサイズの測定を行なった。脂肪肝モデルに関しては、leptin受容体欠損のdb/dbマウスを用いて、加齢マウスには12月齢および20月齢以上のマウスを用いて、70%肝切除を行ない、8週齢マウスと比較検討した。
正常肝における通常の肝再生には、STAT3を中心とする細胞増殖と同様に、PDK1/Aktに制御される細胞成長が重要であった。細胞増殖が十分に起こらない場合には、PDK1/Akt活性化による細胞成長が肝の再生を維持した。逆に、細胞成長が起こらない場合には、細胞増殖により肝再生は維持されなかった。マウス脂肪肝切除後の再生は不良であったが、この原因は細胞内の細胞増殖関連因子であるWee1/Myt1の発現が低下することにより、Cdc2のリン酸化不全によるものと判明した。加齢マウス肝切除後肝再生モデルでも、肝再生は傷害されていたが、この場合も細胞増殖能は保たれており、むしろ切除後アポトーシスが誘導されることにより肝の再生が障害されていると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】16,750千円 (直接経費: 15,400千円、間接経費: 1,350千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】15570154 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞周期制御 / 細胞増殖 / がん / アポトーシス / シグナル伝達 / 細胞周期 / ゲノム複製 / EBウイルス / MAPK

【研究成果の概要】

真核細胞の細胞分裂は染色体複製の完了に始まり、染色体の凝縮、核膜の崩壊から、染色体の分離、細胞質の分裂、娘細胞での核形成へと続く一連の動的な過程であり、その制御機構の解明は生命現象を理解する上で最も重要な課題の一つである。これまでに細胞分裂を制御するリン酸化酵素の存在が知られているが、最近の研究から、細胞膜近傍を起点とするシグナル伝達経路において極めて重要な機能を持つリン酸化酵素が分裂期に強く活性化されることが明らかになり、細胞外刺激に応答するシグナル伝達機構と細胞分裂の制御機構が密接に関連していることを示唆しており、細胞分裂機構の解明には両機構を統合的に理解することが必要と思われる。そこで、細胞周期分裂期に於いて細胞周期に依存してチロシンリン酸化されるシグナル伝達分子の検索を行い、チロシンキナーゼの下流で機能するシグナル分子として同定したDokが細胞分裂期に極めて強くチロシンリン酸化されることを発見した。また、その優性阻害性(dominant negative)変異体の過剰発現が細胞分裂の中期以降においてアポトーシスあるいは細胞分裂の破綻(catastrophe)を招くという予想外の知見を得た。さらに、Dokの優性阻害性変異体が、G1期あるいはS期においては核内に局在することも判明した。以上の結果は、Dokが細胞周期の進行に深く関与していることを示唆しており、Dokは重要な生理機能を担っていると推測された。そこで、Dok遺伝子欠損マウスの詳細な解析を行った。その結果、Dok欠損マウスはヒトの慢性骨髄性白血病に類似した病状を呈し、骨髄球はアポトーシス感受性が亢進していることが判明した。したがって、生体においてDokは細胞増殖つまり細胞周期の制御に重要であることが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,200千円 (直接経費: 3,200千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】12480213 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

GTP結合タンパク質 / 細胞周期 / アポトーシス / RNP Kホモロジードメイン / RNA結合タンパク質 / DT40 / 細胞増殖 / アポートシス / 遺伝子破壊 / Gタンパク質 / 翻訳後修飾

【研究成果の概要】

アポトーシス及び細胞周期の進行制御の関与すると予想されるGTP結合タンパク質ERAのヒトおよびマウスホモログの完全長cDNAクローニングを行った。ついでヒトERAの生理機能及びその作用機構の解明を目指し以下の結果を得た。
(1)ERAはRNA結合タンパク質である。
ERAのC末端側にはRNA結合能を有すると考えられるhn RNP K homology(KH)ドメインが存在する。リコンビナントERAタンパク質とランダムRNAを混合したところ両者の結合が確認された。ERAのRNA結合能はKHドメインを欠損させることにより消失した。KHドメイン欠損がERAの過剰発現によるアポトーシス誘導をも抑制することからERAの生理機能にそのRNA結合能が重要であると考えられた。アポトーシス誘導シグナルにRNAが関与するという報告はなく、新しい細胞生存制御の分子メカニズムが想定された。この内容は学術誌および各種学会において公表した。
(2)ERAは細胞周期進行および細胞の生存に必須である。
ERAの細胞増殖・生存における機能を調べるため、era遺伝子を欠損したニワトリDT40細胞株を樹立した。ERAを欠損した細胞は増殖が著しく低下すると伴にG1期の細胞が増加し、続いてアポトーシスが誘導された。またERA欠損細胞株で観察される表現型は野生型ERA導入により完全に相補されるが、RNA結合ドメインであるKHドメインを欠失したERAでは相補されなかった。この事実はERAが細胞増殖・生存をRNA結合ドメインを介し正に制御することを強く示唆している。これらの結果はすでに各種学会にて報告し、学術誌に印刷中である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】7,600千円 (直接経費: 7,600千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】09044264 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / サイトカイン受容体 / シグナル伝達 / アポトーシス / 造血 / 生殖細胞 / 血管内皮細胞 / 発生 / オンコスタチンM / 血管内皮 / セルトリ細胞 / 始原生殖細胞 / 細胞増殖 / 細胞分化 / 細胞死 / 白血病

【研究成果の概要】

造血細胞の生存はサイトカインに依存しており、サイトカイン除去により細胞死が誘導される。我々はすでにこのサイトカインによる細胞死抑制機能にはサイトカインにより活性化されるRASが重要であることを示した。そこで、RASの変異体を用いてRAS下流のシグナル経路の解析を行い、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を介して細胞死を抑制していることを明かにした。一方、サイトカイン非存在下ではCaspase-3が活性化され、それがサイトカイン除去に伴う細胞死に重要であることも明らかにした。また、我々はサイトカインで誘導される分子としてオンコスタチンM(OSM)を同定していたので、その機能を検索した。造血発生の場として知られている胎生期のAGM(aorta/gonad/mesonephros)領域にOSMの発現を認め、マウスAGM領域の細胞を培養する系にてOSMが血球産生と血管内皮細胞の増殖を促進することを見いだし、OSMが血球と血管内皮に共通の前駆細胞hemangioblastsに作用する可能性を示した。さらに、この培養系を用いて、血球産生に必須な転写因子c-myb,AML-1の作用を解析した。また、OSMは生殖細胞とセルトリ細胞にも作用することを見いだした。さらに、マウスOSM受容体の生化学的解析およびマウスOSM受容体遺伝子クローニングにより、機能的な受容体の分子構造を明らかにし、ヒトOSMとの相違を明らかにした。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】5,500千円 (直接経費: 5,500千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07559018 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / シグナル伝達 / 造血因子 / RAS / STAT / 細胞増殖 / 細胞分化 / 細胞死 / 造血 / JAK / レトロウイルス / アポトーシス / サイトカイン受容体 / JAKキナーゼ / 転写因子 / 分化

【研究成果の概要】

本研究では、IL-3/GM-CSFにより活性化される主要なシグナル経路であるRasとSTAT5の機能解析を行うとともに、それらの変異分子の作成と発現によるシグナル経路の制御法の開発を目指した。
サイトカインによる造血細胞の細胞死の抑制にRASの活性化が重要である。そこで、部分活性型RAS変異体を用いて細胞死抑制のシグナル解析を行った。その結果、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とP13キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していることを明かにした。また、サイトカイン除去により誘導される細胞死においても、FASなどによる誘導的な細胞死と同様にCaspase-3が活性化されること、さらに、それがサイトカイン除去に伴う細胞死に重要であることを示した。しかし、RASによる細胞死の抑制とCaspaseの活性との関連は現在検討中である。
IL-3/GM-CSFなどの造血因子がSTAT5を活性化することを見出していたが、そのサイトカイン機能における役割は不明であった。そこで、STAT5の標的遺伝子のクローニングを行い、SH2ドメインのみをもつ新規分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatinM(OSM)などを得た。CISはSTAT5により誘導される分子でSH2ドメインによりチロシンリン酸化された受容体などに結合してサイトカインのシグナルを抑制する負の調節分子であることを証明した。また、OSMの発現および機能の解析から、OSMは血液幹細胞が発生するaorta/gonad/mesonephros(AGM)領域での発現が認められること、AGM由来の細胞の培養系にOSMを添加することで血液の産生が著しく増加することを見い出した。さらに、この培養系では血管内皮細胞の増殖もOSMにより促進されることなどから、OSMは血管内皮と血球の共通の前駆細胞であるhemangioblastに作用する可能性が示唆された。
優勢抑制型のSTAT5変異体を作成して、STAT5の機能を検討した。IL-3依存的に増殖するBaF3細胞に優勢抑制型STAT5を発現すると、IL-3依存的な細胞増殖が有為に抑制された。この結果はSTAT5で制御されている遺伝子が細胞増殖に関与していることを示唆する。一方、赤芽球系細胞株SKT6はEPOに応答して分子しヘモグロビンを産生する。この細胞にEPO受容体の変異体および優勢抑制型のSTAT5変異体を発現することで、STAT5の活性化がEPOによる赤芽球分化において重要であることが示された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,600千円 (直接経費: 7,600千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07409001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカン / サイトカン受容体 / シグナル伝達 / 造血 / アポトーシス / 分化 / RAS / STAT / サイトカイン / サイトカイン受容体 / 血管内皮 / 発生 / 誘導遺伝子 / 細胞分化 / 造血因子 / JAK / Ras / 幹細胞 / 造血細胞 / 増殖 / 細胞死 / キナーゼ / 細胞増殖

【研究成果の概要】

IL-3/GM-CSF/IL-5受容体の変異体を使ったシグナルの解析からRASとSTAT5という二つの主要なシグナル伝達経路が明らかになってきたので、これらの活性化とサイトカイン機能との関連を中心に研究を展開した。造血細胞はその増殖だけでなく、生存にもサイトカインによる刺激を必要としており、RASの活性化は造血細胞においては細胞死の抑制に重要であることを明らかにした。さらに、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していること、またサイトカイン除去による細胞死にもcaspaseが関与することなどを明かにした。一方、多くのサイトカインはSTAT5を活性化するが、その生理的意義を明らかにするために、STAT5誘導性遺伝子の分離を行い、SH2ドメインをもつ新規シグナル分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatin M(OSM)などを同定した。CISはサイトカインのシグナルをnegativeに制御する分子であることを示した。優勢抑制型のSTAT5変異体を用いた実験から、STAT5が造血細胞の細胞あるいは赤芽球分化に重要な機能をもつことを明らかにした。さらに、STAT5とRASによるシグナル経路がクロストークすることも示した。STAT5誘導遺伝子として同定されたOSMの機能の検索を行い、胎生期での血球発生過程や生殖細胞などに作用があることを示した。また、遺伝子クローニングによりOSM受容体の分子構造も明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1998

【配分額】36,500千円 (直接経費: 36,500千円)