【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】21659350 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Bcl-2 family / 破骨細胞 / Bcl-2 / Mcl-1 / Bisphosphonate / Erk / Akt / Apoptosis

【研究成果の概要】

我々はこれまでにpro-apoptotic Bcl-2ファミリーであるBimのノックアウトマウスでは破骨細胞の生存期間は延長しているが骨吸収活性は低下していること、一方anti-apoptotic Bcl-2ファミリーであるBcl-xの破骨細胞特異的ノックアウトマウスにおいては破骨細胞の生存期間が短縮する一方で骨吸能が亢進していることを明らかにした。本年はあらたなBcl-2ファミリー分子であるMcl-1に注目して破骨細胞における役割を検討した。Mcl-1はBcl-2 familyに属する蛋白の1つであり、様々な細胞においてアポトーシスを抑制する働きを持つことが知られている。M-CSF,RANKL,TNF-alpha,IL-1等の添加によって破骨細胞におけるMcl-1発現の増加がみられ、さまざまな骨代謝疾患や炎症性疾患においてMcl-1が関与している可能性が示唆された。プロテアソーム阻害剤MG132添加によって破骨細胞におけるMcl-1の発現は上昇し、免疫沈降法によりMcl-1がユビキチン化されることが確認された。このことより、破骨細胞のMcl-1の代謝にはユビキチン-プロテアソーム系によるタンパク分解系が関与していると考えられた。レトロウイルスやアデノウイルスを用いてMcl-1の発現量を増加させた破骨細胞の細胞生存能は亢進したが、骨吸収能は低下した。これとは逆にMcl-1の発現量をノックダウンやノックアウトによって減少させた破骨細胞の細胞生存能は低下し、骨吸収能は亢進した。以上の結果より破骨細胞においてMcl-1は細胞生存能に対しては正の制御を行うが、骨吸収能に対しては逆に負の制御を行う事が明らかになった。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】3,000千円 (直接経費: 3,000千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】20249064 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨 / 軟骨 / 筋 / 神経 / Bcl-2ファミリー / Bcl-xL / 破骨細胞 / TGF-beta / Cbl-b / RANTES / VICOM / Oligodendrocyte / 運動器 / 筋細胞 / アポトーシス / c-Src / Bc1-2 / RFN10 / apoptosis

【研究成果の概要】

「運動器」は動物の生命維持に必要不可欠な活動である「運動」を担う器官の総称であり、骨、軟骨および筋組織など直接運動に関与する組織、さらにはこれらの働きを調節制御する神経組織をも網羅する概念である。本研究では運動器を担う骨、軟骨、筋、神経の機能制御メカニズムをアポトーシス調節分子であるBcl-2ファミリー分子の役割を中心に解析した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2008 - 2011

【配分額】46,540千円 (直接経費: 35,800千円、間接経費: 10,740千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】18591652 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

破骨細胞 / アポトーシス / Bcl-2ファミリー / 骨吸収 / Bc1-2ファミリー

【研究成果の概要】

骨組織は破骨細胞による骨吸収とそれに続く骨芽細胞による骨形成が間断なく行われることによってその恒常性を維持している。骨代謝のイニシアチブをとっている破骨細胞は骨吸収を終えると速やかにアポトーシスに陥る。われわれはBcl-2ファミリーに属するアポトーシス促進分子Bimが破骨細胞のアポトーシスにおいて重要であり、骨吸収という機能調節にも大きな役割を果たしていることを報告した。しかし、Bcl-2,Bcl-xLなどのアポトーシス抑制分子による破骨細胞の生存・骨吸収能に対する役割については、未だに不明である。我々は、Bcl-2ファミリー分子を有機的分子複合体としてとらえ、Bcl-2、Bcl-2/Bim遺伝子欠損マウス、Bcl-xコンディショナルノックアウトマウスを作製し、破骨細胞のアポトーシス、骨吸収における役割を明らかにした。アポトーシス抑制分子であるBcl-2,Bcl-xLは、それぞれのノックアウトマウスのex vivoの実験により破骨細胞の生存に促進的に働いた。一方興味深いことに、骨吸収に関してBcl-2は促進的に、Bcl-xLは抑制的に作用していることが、ex vivoかつin vivoの実験で明らかとなった。また、Bcl-2のノックアウトマウスは腎不全、免疫系の異常を呈し、早期に死亡することが知られており、Bcl-2ホモノックアウトにBimヘテロノックアウトを加えたノックアウトマウスを作成し、Bcl-2の骨組織の役割を検討した。その結果、Bc1-2は成体マウスにおいて骨量を維持するのに重要であることがわかった。このようにBcl-2ファミリーは細胞の生死のみならず、その細胞固有の機能にづいても重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,980千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 480千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】17591550 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / 内軟骨性骨化 / Bcl-2ファミリー / 無機リン酸 / 軟骨分化 / 分子生物学

【研究成果の概要】

この研究は、軟骨内骨化において重要な役割を果たす軟骨細胞分化・アポトーシスの分子メカニズムの解明を目的として行われた。昨年度までの成果として、我々は培養軟骨細胞を用いて軟骨細胞の分化およびアポトーシスを誘導する実験系を確立した。具体的には前軟骨細胞株であるATDC5にインスリンによる初期誘導をかけた後、20mMの無機リン酸刺激を加えてアポトーシスを誘導した。リン酸刺激後ミトコンドリアからのシトクロムcの放出が確認され、ミトコンドリア経路を介したアポトーシスであることが判明した。さらに、小胞体ストレスが関与していること、アポトーシスには(肥大分化の制御分子である)Runx2は必要でないこと、などが判明した。
今年度は、ミトコンドリアの膜電位を調節する分子群であるBcl-2ファミリーについて調べた。Bcl-2ファミリーはアポトーシスを誘導する分子および抑制する分子で構成されているが、アポトーシス誘導分子であるBnip3をRNAiにてノックダウンすることでアポトーシスは抑制された。逆に、アポトーシス抑制分子であるBcl-xLの強制発現でアポトーシスが抑制され、RNAiによるノックダウンでアポトーシスは亢進した。無機リン刺激後Bcl-xLの発現量は不変であったがBnip3の発現量は上昇し、Bcl-xLとBnip3は複合体を形成した。マウス成長板における発現量を免疫染色で調べたところ、Bcl-xLは全軟骨層でほぼ均一に発現していたのに対し、Bnip3は肥大軟骨層に強く発現していた。以上より、肥大軟骨層における無機リン濃度の上昇がBnip3の発現上昇を促し、BnipはBcl-xLに結合してその抗アポトーシス作用を阻害することで軟骨細胞をアポトーシスへ導くことが判明した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】13680726 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

apoptosis / ERKs / phoslactomycin / PP2A / Bcl-2 / Erk / Bc1-2 / ミトコンドリア / リン酸化 / 細胞周期 / ERK2

【研究成果の概要】

Bcl-2のリン酸化の意義を解析するために、Bcl-2低発現細胞であるHepG2細胞に野生型Bcl-2および種々の変異型Bcl-2を発現させ、その機能解析を行った。様々な変異型Bcl-2を細胞に発現させた結果,通常ミトコンドリアに局在するBcl-2から膜貫通領域を欠損させ、局在を変化させた変異型Bcl-2(以後、Bcl-2ΔTMと略)においてBcl-2ΔTMタンパク質が恒常的にリン酸化されていることを見出した。細胞内におけるBcl-2ΔTMのリン酸化部位の同定を試みたところ,87番目のセリンが恒常的にリン酸化されていることが確かめられた。また、種々のリン酸化酵素阻害剤を用いてBcl-2ΔTMリン酸化酵素の同定を試みた結果,MEK1阻害剤のPD98059とU0126がBcl-2ΔTMのリン酸化を抑制することを見出した。さらに、in vitroのリン酸化反応実験によりMEK1の下流の因子であるERKがBcl-2ΔTMの87番目のセリンをリン酸化することが確かめられた。このリン酸化部位は、細胞内におけるリン酸化部位と一致していた。一方で、野生型Bcl-2とBcl-2ΔTMの双方がERKと結合できるが、野生型Bcl-2はミトコンドリアでPP2Aと複合体を形成していることから恒常的なリン酸化が観察されないことが分かり、Bcl-2ΔTMはPP2Aと結合できないことから恒常的にリン酸化されている事が分かった。さらに、正常ヒト血液由来Bcl-2は恒常的にリン酸化されており、培養がん細胞でのそれは脱リン酸化体であることが確かめられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】泌尿器科学

【研究領域課題番号】13671674 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

前立腺癌 / bcl-2 / アポトーシス / diethylstilbestrol / 放射線治療

【研究成果の概要】

前立腺癌由来樹立細胞株PC-3およびJCA-1細胞においてbcl-2 antisense oligonucleotide (bcl-2 AS ODN)は濃度依存性に抗腫瘍効果およびアポトーシスを誘導し、Bc1-2蛋白の発現を抑制した。bcl-2 AS ODNを併用したときの放射線治療による抗腫瘍効果の増強をcolony forming assayを用いて検討したところ、bcl-2 AS ODNはbcl-2 S ODNやcationic lipidに比べて、1Gyの放射線治療による平均colony数を有意に抑制した(colony数:26.5vs38.0、66.7)。また2Gyの放射線治療併用でのcolony数はそれぞれ16.2、31.4、52.0でありbc1-2 AS ODNは放射線治療の抗腫瘍効果を増強することが示された。
Diethylstilbestrol (DES)はPC-3細胞に対して濃度依存性の細胞障害活性ならびに細胞内活性酸素(ROS)を誘導した。Buthionine sulfoximine (BSO)は細胞内glutathione濃度を有意に低下させDESの細胞障害活性ならびにDESによる細胞内ROS誘導能を有意に増強させた。bcl-2 AS ODNはDESにより誘導される殺細胞効果ならびにアポトーシスを有意に増強したが細胞内のglutathione濃度やDESによるROS誘導能に変化を与えなかった。
以上の結果より、PC-3細胞においてBSOはDESで誘導される抗腫瘍効果やROSの産生を増強することが示された。一方、bcl-2 AS ODNはPC-3細胞内のglutathione濃度やROS産生量に有意な影響を及ぼすことなく,アポトーシスを介する機序によりDESで誘導される抗腫瘍効果を増強することが示された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】泌尿器科学

【研究領域課題番号】13470341 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

bcl-2 / NFkappaB / 泌尿器系癌 / STAT3 / 分子標的 / 前立腺癌 / NFκB / アポトーシス / 腎細胞癌 / TRAIL / NF-κB

【研究成果の概要】

腎細胞癌において癌の進行と比例してNFκBの活性化が認められた。腎細胞癌培養細胞においてNFκBの特異的な抑制因子であるIκBαのcDNA(AxIκBαΔN)を導入することにより増殖が抑制された。これら感受性の細胞株ではカスパーゼ活性の増強とアポトーシスの誘導を認めた。NFκBの恒常的活性化が生じている細胞はTRAILに非感受性であり、TRAILの感受性とAxIκBαΔNの感受性とは逆相関した。膀胱癌細胞株やホルモン非依存性前立腺癌細胞株においてNFκBが活性化されており、新規に開発されたNFκB阻害剤であるDHMEQはNFκB活性を抑制するとともにアポトーシスを誘導した。アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞においてbcl-2が発現しており、antisense bcl-2 oligodeoxynucleotideはアポトーシスを誘導し、さらにはdiethylstilbestrolの殺細胞効果を増強した。CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)は細胞の分化誘導に関する遺伝子およびサイトカインの発現を制御する転写因子群であるが、局所浸潤を認める腎癌では限局性の腎癌に比べて活性が有意に増強しており、C/EBPβの活性化は腎細胞癌の浸潤性増殖と関連し、新たな治療に結びつく可能性が示唆された。腎細胞癌培養細胞においてIL-6がSTAT3のDNA bindingを増加させ、IL-6による腎細胞癌の増殖刺激においてSTAT3が重要な役割を果たしていることが示された。さらにはJakに特異的な阻害剤であるAG490はIL-6により誘導されるSTAT3の活性化を抑制し、アポトーシスを誘導し、STAT3のsignal pathwayを抑制することが腎細胞癌に対する新たな治療戦略となりうることがしめされた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】14,300千円 (直接経費: 14,300千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13770114 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

EAT / ノックアウト・マウス / bcl-2 / 発生 / 初期胚 / 胎児性癌 / 胚性幹細胞 / アポトーシス / 分化 / 胎児性癌細胞 / 遺伝子ノックアウト法

【研究成果の概要】

EAT遺伝子は、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子として単離され、bcl-2関連遺伝子に属する。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制することが示されている。本遺伝子のノックアウト・マウスは胚性致死であることが知られている。本研究では、さらにEATの発生段階および個体レベルでの機能を詳細にするために、マウスEC、ES細胞においてEATを欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、コンディショナル・ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行なうことを目的とする。
1.EATをコンディショナルにノックアウトするためのターゲッティング・ベクターを作製した。EATは、3ヶのexonからなるが、(1)exon1の両端にloxP配列を挿入したベクターおよび、(2)exon2の両端にloxP配列を挿入したベクターの2種類のターゲッティングベクターの作製を終了した。
2.上記ターゲッティング・ベクターをF9細胞、ES細胞に導入し、一方の対立遺伝子でexon1を挟むようloxP配列が挿入されたES細胞を10クローンを得た。現在これらのクローンを用いてマウスを作製している。
EATは初期胚発生過程のみならず、成獣の多くの臓器(主に上皮)で発現している。コンディショナル・ノックアウトマウスを作製し、成獣でEAT遺伝子をノックアウトすることにより、EATが機能している臓器やEATが果たしている機能が解明されると期待される。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13470053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / 発生 / EAT遺伝子 / ES細胞 / コンディショナル・ターゲッティング / bcl-2ファミリー / 遺伝子改変マウス / EAT / bcl / mcl-1 / mcl1 / トランスジェニック・マウス / ミトコンドリア / 細胞死

【研究成果の概要】

EAT/mcl1遺伝子は、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子として単離され、bcl-2関連遺伝子に属する。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制すること、本遺伝子を過剰発現するトランスジェニック・マウス(Tg)では、膵ラ氏島の過形成が生じることが知られている。本研究では、EAT/mcl1の発生段階および個体レベルでの機能を更に詳細にするために、胚性幹細胞(ES細胞)においてEAT/mcl1を欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行った。
Cre-loxPシステムを用いてEAT/mcl1遺伝子をマウス個体、ES細胞においてコンディショナルにノックアウトするために、EAT/mcl1のexon 1をloxPで挟むような変異を導入するターゲッティング・ベクターを導入することによりES細胞(TT2細胞)の一方の対立遺伝子に変異を導入することに成功した。11個のES細胞のクローンが得られ、5個のES細胞をマウス初期胚(胚盤胞)へ注入することによりキメラマウスを得た。それらより3ラインのマウスのラインを確立した。これらのマウスをCre recombinaseを発現するトランスジェニック・マウスと交配することにより以下のマウスを得た。1)EAT/mcl1のexon 1が破壊されたマウス(EAT/mcl1遺伝子1個のみ破壊されたヘテロ接合性のノックアウトマウスであり、表現形は、現在のところ、形態学的には野生形と同様と考えられる。このことはEAT/mcl1の発現量が通常の1/2となってもマウスは、正常に発生.分化することを示唆している)。2)EAT/mcl1のexon 1の両端にloxP配列が挿入されたマウス(このマウスは、両アレルとも正常なEAT/mcl1を有するが、臓器特異的Creトランスジェニック・マウスの交配により、コンディショナル・ノックアウトを作成することが可能である)。また、MEOXマウス(胎生5日目以降に、胚盤葉上層(将来、胎仔となる領域)特異的にCre recombinaseを発現するマウス)の導入を終了した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2004

【配分額】14,100千円 (直接経費: 14,100千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09780648 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ / ショウジョウバエ / 細胞死 / 線虫 / アポトーシス / プロテアーゼ / ICE / Bcl-2 / 酵母

【研究成果の概要】

CED-4はcaspaseの活性化因子として細胞死の実行に深く関与している。CED-4の機能解析を生化学的・分子遺伝学的に行うことを目的としてショウジョウバエを用いたCED-4の機能評価系を確立した。ショウジョウバエ由来の培養細胞であるS2にCED-4を過剰に発現させることによってcaspaseの活性化を伴う細胞死を誘導することが出来た。CED-4によって活性化されるcaspaseをaffinitylabelによって同定した結果、dr ICEが活性化されていることが明らかになった。免疫沈降実験によって細胞内ではCED-4とdr ICEが複合体を形成することが明らかになり、caspaseとの直接の相互作用がその活性化に必要であることが示唆された。また、CED-4内のP-loop motifがcaspaseの活性化に重要であり、P-loopmutationはdominant negativeにCED-4による細胞死を抑制した。ショウジョウバエ複眼に過剰発現させたCED-4はcaspaseの活性化を伴った細胞死を誘導し、生体でのCED-4の機能を評価する系が確立された。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】09877242 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大腸癌 / Apoptosis / Bcl-2 / Bax / p53 / Caspase / アポトーシス / テロメラーゼ

【研究成果の概要】

悪性腫瘍では、細胞増殖と細胞死のバランスが破綻し無秩序な細胞増殖が生じている。大腸癌におけるApoptosisの異常を明らかにする目的でApoptosis関連遺伝子の発現を解析した。大腸癌切除例、ヒト大腸癌細胞株を対象として、Apoptosis抑制因子Bcl-2、Bcl-XL,Apoptosis促進因子Bax、Bad、Bak、Apoptosis EffectorであるCaspase Family(ICE、CPP32、ICH-1L)、さらに、癌抑制遺伝子p53の発現をWestern Blottingで解析し、Densitometerを用いて定量化、癌部分と正常粘膜のそれぞれの発現を比較した。すべての症例において、Bax、Bad、Bak、CPP32、ICH-1Lは癌、正常粘膜の胃方に発現が認められた。Bcl-XL.Bax.Bad.CPP32、ICH-1L、p53は、正常粘膜に比較して癌で発現が高い傾向が認められた。逆に、Bcl-2、Bak、ICEは、癌に比較して正常粘膜で発現が高い傾向が認められた。個々のの腫瘍における各Apoptosis関連遺伝子の発現パターンは多様であるが、高頻度に認められた顕著な変化は,癌におけるBcl-XLの発現上昇、Bcl-2の発現減少であった。各々の因子の間に朗らかな相関は認められなかった。
大腸癌におけるApoptosisの抑制には、Bcl-XLの過剰発現、Bakの発現低下が関与している可能性が示唆された。特に、Bcl-XLの発現上昇は、大腸癌の発生に重要な役割を果たしている可能性が考えられる。癌で認められたApoptosis促進因子Bax、Badの発現上昇、Apoptosis Effector CPP32、ICH-1Lの発現上昇は、生体反応として、癌細胞を排除するためのApoptosis誘導機構も活性化されている可能性を示唆するものと考えられる。個々の腫瘍で異なる、Apoptosis関連遺伝子の発現異常は個々の腫瘍の生物学的性質の多様性を反映している可能性が考えられる。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】07671368 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Apoptosis / 放射線療法 / 化学療法 / 癌 / Bcl-2 / p53 / 食道癌 / 大腸癌 / bcl-2

【研究成果の概要】

食道癌と大腸癌細胞株において、Apoptosis関連遺伝子p53、Bcl-2、Bax、Bcl-XL、Bcl-XS、Bak、Badの発現をWestern Blottingを用いて解析した。p53の発現は、食道癌細胞株、大腸癌細胞株のそれぞれ約50%と約80%に認められた。一方、Bcl-2の発現は、食道癌細胞株、大腸癌細胞株のそれぞれ約30%と約20%に認められた。分子量の異なる2種類のBcl-2蛋白を発現している食道癌細胞株が認められた。p53、Bcl-2、Baxの発現の間に明らかな相関は認められなかった。p53遺伝子解析から、Mutant p53蛋白を発現している細胞株とWild-type p53蛋白を発現している細胞株があることが示唆された。Bax、Bcl-XL、Bcl-XS、Bak、Badの発現は、ほとんど全ての細胞株で認められたが、その発現量には細胞株の間で相違が認められた。食道癌細胞株における化学療法剤MMC、CDDPに対する感受性を解析した。MMC、CDDPを加えて、p53蛋白の発現上昇が認められる細胞株では、Apoptosisが誘導され、抗癌剤に対する良好な感受性が観察された。一方、p53蛋白の発現上昇が認められない細胞株では、抗癌剤に対する抵抗性が認められた。したがって、MMC、CDDPに対する感受性は、細胞がApoptosis誘導刺激に対する反応性を保持しているか否かにかかっており、p53-dependentなApoptosisが関与していることが示唆された。さらに、直腸癌に対する放射線療法感受性とp53、Bcl-2、p21の発現の相関を検討し、p53(+)/p21(-)の腫瘍は放射線療法に対して抵抗性を示し、p53(-)/P21(+)の腫瘍は放射線療法に対して良好な感受性を示すことが明らかになった。化学療法、放射線療法に対する感受性を規定する因子として、p53が重要であると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)