【研究領域課題番号】20K06729 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

造血 / 造血幹細胞 / 両生類 / 造血因子 / オミクス / アフリカツメガエル / ネッタイツメガエル / 血球 / ゼノパス / 幹細胞 / 肝臓 / 脾臓 / 骨髄

【研究成果の概要】

ツメガエル（ゼノパス）の成体の造血は，肝臓，脾臓，骨髄の複数の造血器が分担して血球を産生する。そのため複数造血器の役割分担や組織環境の違いを解明するための魅力ある研究対象である。ツメガエルの各血球，すなわち赤血球，白血球，栓球（哺乳類の血小板の機能を担う細胞）はいずれも造血幹／前駆細胞（HSPC）が起源である。本研究では複数の造血器に存在するＨＳＰＣの特性の解明と分離法を確立しつつある。第２年度では第1年度で検討した細胞膜蛋白質を網羅的に同定するプロテオミクスにおいて、試料調製における界面活性剤処理の条件をさらに検討した。例えば飼育温度環境が異なるアフリカツメガエルの赤血球膜蛋白質をモデルにすると，飼育温度の違いによって，量的変動を示す赤血球膜上の膜蛋白質が比較解析可能になった。従ってこの方法を適用して複数臓器間のHSPC膜発現分子の差異が検出可能であると考えた。また細胞にレーザー光を照射して得られる散乱光とモノクローナル抗体２種の結合による蛍光を利用するフローサイトメトリーを用いて、肝臓ＨＳＰＣの分離法を検討した。再現性の確保が課題になるがN/C比が大きく未分化な細胞形態をもつ集団は，実験実施者に依存せずに再現性良く分離可能であった。このように進捗していたところ，シングルセルRNA-Seq（scRNA-seq）法によって１細胞単位で発現する全mRNAを同定，定量，分類する報告が相次いた。本研究の発展にとって，これらの新手法は大きな貢献をもたらすと判断し，特に肝臓，骨髄のＨＳＰＣを対象とするscRNA-seqを実現するための準備に入った。そのうち肝臓，骨髄それぞれの臓器からmRNAを回収するプロトコルをほぼ確定し，まずバルクmRNA解析に着手した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】26253023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

炎症 / 再生 / 線維化 / サイトカイン / イメージング / 肝炎 / 胆管 / 肝臓 / 肝障害 / 肝細胞 / 間葉系細胞 / 幹細胞 / 免疫

【研究成果の概要】

種々の病因による肝炎から肝幹／前駆細胞の活性化を介した再生応答を、肝臓構成細胞間の相互作用に着目して解析を行った。炎症により肝前駆細胞の活性化を伴う胆管増生は胆管の増殖を伴うリモデリングであることを細胞系譜解析および肝臓の３次元構造の可視化法により示した。さらに、増殖性の胆管細胞は胆管の末端部に局在すること、増殖を始めた細胞の運命はstochasticに決まることを見いだした。また、肝臓でのサイトカインの過剰発現による新規肝線維化モデルを開発し、線維化誘導機構の一端を明らかにした。IL-4過剰発現により特徴的なNK細胞が出現することを見いだしその性状解析を行った。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】40,820千円 (直接経費: 31,400千円、間接経費: 9,420千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12557096 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞増殖 / 細胞分化 / サイトカイン / 肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から純化された肝幹細胞画分であるc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞を回収し、これらのクローナルな培養系を用いて、肝細胞および胆管細胞への分化誘導能を有する新規サイトカインのスクリーニングを行うことを目的として研究を行った。肝幹細胞から胆管細胞への分化誘導能を有する培養上清を得て、さらに、この培養上清の特定分子量分画にc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞の増殖抑制活性が限定的に存在することを確認した。この分子量分画から活性タンパク・ペプチドの精製を試みたが、結果として培養液中の血清の存在が困難要因となり精製には至らなかった。一方、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞に与える既知の各種サイトカイン、細胞外マトリックス、転写因子C/EBPsの影響に関するスクリーニング解析により、hepatocyte growth factor(HGF)やC/EBPsが肝幹細胞の初期分化に重要な役割を果たしていることを明らかにした(Development 130:2513-2524,2003)。
今後、肝幹細胞の分化・増殖機構を精度の高い解析系を用いて、ひとつひとつ丹念に検証していくとともに、実用化技術の開発に向けた疾患モデル動物における治療効果についても並行して検討する必要がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】9,800千円 (直接経費: 9,800千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12307023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 肝臓 / 幹細胞 / 再生

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から肝幹/前駆細胞画分であるc-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞を選別・回収する技術を確立した。さらに、肝幹細胞の純化を進め、胎児肝臓中の僅かに0.3%を占めるにすぎないc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞中に限定的に肝幹細胞が存在することを明らかにした。そして、このc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞は、多分化能を維持したまま増殖可能で自己複製能を有していること、膵細胞や腸管上皮細胞など他の細胞系列の細胞へ分化する可塑性を有していることなどを明らかにした。これらのc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞が有する特性は、この細胞が厳密に定義し得る多能性肝幹細胞であることを如実に示している。これは、今まで概念としてしか捕らえられていなかった肝幹細胞の実体を初めて明確にしたという点で、幹細胞生物学的に意義の深い研究成果であったといえる。また、応用科学的側面からは肝幹細胞の分離・操作の基盤技術が確立されたといえ、今後の先進医療への応用が期待できる研究成果である。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】21,310千円 (直接経費: 19,000千円、間接経費: 2,310千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】11877192 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学 / 自己修復能

【研究成果の概要】

単離した肝細胞集団の中から、多能性を持つ肝幹細胞をFACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた細胞分離法により濃縮・純化し、それらの機能解析を行うことを目的として研究を行った。昨年度までの研究により、c-Kit-CD49f+CD29+ CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能の高いコロニー形成能を有した細胞が存在し、肝細胞と胆管細胞という異なる細胞系列へと分化し得ることを明らかにした(Hepatology 32(6):1230-1239,2000.)。今年度は、c-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞の画分化を段階的にすすめ、自己増殖能をも備えた幹細胞画分を明らかにすることを試みた。その結果、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能、多分化能、自己複製能、組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞(hepatic stem cell)が高頻度に存在することが判明した。また、この肝幹細胞の少なくとも増殖にhepatocyte growth factor(HGF)が必須の因子であることを明らかにした。今後、さらに、純化した肝幹細胞の分化・増殖・自己複製機構を培養系を用いて解析し、「臓器再生」の基盤となる知見および技術を確立する予定である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】10770579 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 幹細胞 / 分化 / 増殖 / 自己複製 / 肝細胞 / 胆管細胞 / liver / regeneration / organogenesis / stem cell / cell growth / differentiation

【研究成果の概要】

単離した肝細胞集団の中から、多能性を持つ肝幹細胞をFACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた細胞分離法により濃縮・純化し、それらの機能解析を行うことを目的として研究を行った。まず、in vitro肝幹細胞機能解析系の確立を目的として、マウス胎仔肝細胞の培養系を検討し、1個の細胞を始点とするクローン性コロニーを効率よく誘導可能な培養条件を決定した。そして、このコロニー形成能を指標として、FACSとモノクローナル抗体により画分化したマウス胎仔肝から単離した細胞群の解析を行った。その結果、胎仔肝中の非血球画分であるCD45^-TER119^-細胞から段階的に画分化を進め、最終的にc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞中に限定的、かつ、高頻度に増殖能の高いコロニー形成能を有した細胞が存在することが判明した。さらに、それらのクローン性コロニーを拾い上げRT-PCRおよび免疫染色法による細胞系列マーカーの発現の検討を行った。その結果、肝細胞マーカーと胆管細胞マーカーの発現を共に確認した。すなわち、1個のc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞から肝細胞と胆管細胞という異なる系列の細胞が分化し得ることを明確に証明した。また、FACSにより分離したc-Kit^-CD49f^+CD29^+CD45^-TER119^-細胞は、in vivoにおいても肝組織再構築能を有することを細胞移植により確認した。これらの結果は、マウス胎仔肝臓中のc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞は、高い増殖能、多分化能、組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞(hepatic stem cell)であることを示唆する。すなわち、本研究により、精度の高い肝幹細胞の純化・回収法が世界に先駆けて初めて確立された。これらの成果に関する論文は、現在投稿中である。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】08877197 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 幹細胞 / 遺伝子治療

【研究成果の概要】

単離した肝細胞集団の中から、極小数しか存在せず、かつ形態によって区別ができない多能性を持つ肝幹細胞を、FACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた回収法により濃縮・鈍化し、それらの培養系・細胞移植系の確立を行うことを目的として研究を行った。まず、in vitro肝幹細胞機能解析系の確立を目的として、マウス胎仔肝細胞の培養系を検討した。ある細胞の多分化能を示すには、1個の細胞から複数の異なった細胞系列の成熟細胞が分化派生することを示すことが必須である。そこで、培養開始時の播種密度を極めて低くすることにより、1個の肝細胞を始点とするクローン性コロニーを効率よく誘導可能な培養条件を比較した。その結果、細胞外マトリックスとしてはラミニン、コラーゲン-IVなどの基底膜を構成するマトリックスが有用であり、サイトカインではhepatocyte growth factor (HGF)の添加が必須であることが判明した。最も良い条件では、6日間で1個の胎仔肝細胞がクローン性に1000個以上の細胞に増殖した。また、in vivo解析系としてCSA congenic mouseをもちいた肝細胞移植系を確立した。次に、マウス胎仔肝から単離した細胞群を、FACSとモノクローナル抗体により分画化することを試みた。まず最初に、血球特異的抗原であるCD45およびTER119をもちいて、胎仔肝中の非血球分画を明らかにした。そして、CD45^-TER119^-細胞をFACSで回収し上記の機能解析を行ったところ、高い増殖能・多分化能を持ち、長期間にわたってin vivoにおいて肝小葉的構築を保つことが判明した。したがって、この細胞群中に肝幹細胞が存在することが強く示唆された(投稿準備中)。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)