【研究領域課題番号】18H02966 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

腱 / 靱帯 / 細胞分化 / 幹細胞 / Scleraxis / Sox9 / 縫合部 / Sxleraxis / Enthesis / 歯根 / 靭帯 / 顎関節

【研究成果の概要】

本研究では、硬組織の連結に寄与するScx陽性細胞やScx/Sox9陽性細胞の頭蓋顎顔面形成プロセスにおける時間的・空間的局在変化を、ScxTomato;Sox9GFPマウス胚を用いて解析した。また、ScxGFP Tgマウス胚由来の線維芽細胞から樹立したScxGFP iPS細胞を用いて、in vivoの腱・靱帯分化過程を忠実に反映する分化誘導系を構築し、single cell RNA-seqを行った。そのデータセットとScx欠失マウスでのトランスクリプトームの結果から、腱・靱帯細胞分化過程でScxと関連して機能する遺伝子群を同定した。

【研究の社会的意義】

腱・靱帯は、硬組織と筋肉の連結の要となる組織である。とりわけ、硬組織と腱・靱帯の接合部は、運動機能を円滑に維持するために重要な部位である。本研究では、この接合部の形成に寄与する細胞集団の発生過程におけるダイナミックな局在変化を明らかにし、分子レベルで、その特性を解析した。これらの知見は、超高齢社会における我が国において、「寝たきりによる要介護状態」や「加齢」に伴う関節拘縮や筋萎縮等を予防・改善する治療法の確立に向けた基盤技術につながることが期待される。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】発生生物学

【研究領域課題番号】16H04798 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大脳皮質 / 初期ニューロン / 細胞分化 / 進化 / 大脳新皮質 / カハールレチウス細胞 / サブプレート細胞 / 遺伝子発現 / カハール・レチウス細胞 / サブプレート / 幹細胞 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 神経科学

【研究成果の概要】

哺乳類以降で急速に発達し、ヒトにおいて最も数が増大した大脳皮質で最初に誕生するニューロン群は、その発現分子も含め、これまで知見が極めて乏しかった。本研究では大脳皮質初期ニューロンの分子多様性の意義を明らかにすることで、哺乳類特有の大脳皮質の形成機構を解明することを目的とした。特にゲノムワイドアプローチによる初期ニューロンに特異的に発現する新規遺伝子群の同定、異種間遺伝子導入・細胞移植により、大脳皮質初期ニューロンに発現する遺伝子の多様性が、哺乳類特有の大脳皮質構造の形成に重要な役割をもつことが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】11,960千円 (直接経費: 9,200千円、間接経費: 2,760千円)

【研究分野】ゲノム医科学

【研究領域課題番号】15K14431 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNAメチル化 / 酸化的脱メチル化過程 / gene body領域 / 転写伸長反応 / 細胞成熟 / 心筋細胞 / ゲノム / エピゲノム / H3K36トリメチル化 / Gene body領域 / ゲノムワイド / 細胞分化 / 幹細胞 / 転写伸長

【研究成果の概要】

本研究計画はglobal DNAメチル化修飾をバックグラウンドとする哺乳類ゲノムにおいて、gene body領域のエピジェネティック状態が細胞成熟に関与する可能性を検討し、これをもとに細胞成熟の評価および誘導を目指す。当初の成熟誘導法の樹立の計画に先立ち心筋細胞と肝細胞の比較を行ったところ、低メチル化を特徴とするgene body領域エピジェネティック・ドメインは心筋細胞により強く、他の細胞にはあまり顕著に見られない特徴であることがわかった。また、DNA脱メチル化代謝中間産物の解析により酸化的脱メチル化過程がこの活性エピジェネティック・ドメインの構築に関与している可能性が示された。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】解剖学一般(含組織学・発生学)

【研究領域課題番号】15K15022 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞分化 / 組織形成 / 乳腺 / 幹細胞 / ダイレクトリプログラミング / 癌幹細胞 / リプログラミング / 遺伝子スクリーニング / トラップ法 / 乳腺組織 / 脱分化

【研究成果の概要】

レポーターマウスの乳腺上皮細胞(MEC)の不死化に成功しスクリーニングが効率化した。当初期待していた115個の遺伝子には活性がなく、より大きな遺伝子セットを評価する必要があった。そこでアノテーションされていないnon-coding RNAなどを含む遺伝子セットを大量に評価可能な実験系としてトランスポゾンを用いた遺伝子発現・同定技術を考案した。開発したベクターをレポーター細胞に導入し、4つの陽性クローンを得ることに成功した。その内1クローンから候補遺伝子が同定され、さらに解析を進めているところである。また、トラップ法の技術を応用し、幹細胞化遺伝子の機能評価のための各種技術を構築した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】25670846 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 骨代謝学 / 細胞周期 / 細胞分化 / 幹細胞 / 骨形成 / 骨吸収 / 骨軟骨分化 / 骨再生

【研究成果の概要】

本研究では、細胞周期制御との関連が強いRunx2と同じruntファミリーに属するRunx1とRunx3が間葉系細胞の骨分化能促進機能を有すること、ならびに、高分化能を有する間葉系細胞において古典的Wnt経路の抑制によってサイクリンD1発現が抑制されており、サイクリンD1が骨軟骨分化の振り分け機能を有すること、を明らかとした。さらに細胞周期制御において重要な機能を果たしていると想定された分子の中から、破骨細胞分化の際に発現が上昇する一方で骨芽細胞分化の際に発現が低下する分子、逆に破骨細胞分化の際に発現が低下する一方で骨芽細胞分化の際に発現が上昇するという発現変動パターンを示す分子を複数同定した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】解剖学一般(含組織学・発生学)

【研究領域課題番号】25670100 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 細胞分化 / 組織形成 / 乳腺 / 脱分化 / 再生医療 / 乳腺幹細胞

【研究成果の概要】

分化した乳腺上皮細胞(MEC)を乳腺幹細胞へ脱分化することが報告されているSLUG/SOX9を一過的に過剰発現させるベクター系を構築し、発現させたMECから乳腺の再構築が確認されたが、効率が著しく悪かった。そこで、ドナーマウスをrtTA発現マウスに変更、乳腺幹細胞維持培養法の検討、高効率化遺伝子スクリーニング、を実施した。研究期間内に乳腺幹細胞維持培養法の確立に成功した。また、幹細胞性を評価可能なレポーターマウスを作製し、これらの技術を統合することにより簡便に効率よくスクリーニング可能となった。しかしながらまだ効率を著しく向上させるダイレクトリプログラミング制御因子の同定には至っていない。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】解剖学一般(含組織学・発生学)

【研究領域課題番号】24590232 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アフリカツメガエル / ネッタイツメガエル / ヒトiPS細胞 / 細胞分化 / 発生生物学 / 幹細胞

【研究成果の概要】

本研究では２種類の内胚葉へのスイッチ因子の探索を試みた。DNAアレイから見つかった因子や他の動物の研究から効果が示唆されている因子を数多くクローニング・過剰発現し、スイッチ機能の保持しているかを確かめたが現在のところ確定的な情報は得られていない。引き続きスクリーニングを行うことを計画している。また、iPS細胞の単一の内胚葉への分化を引き起こす方法については、本研究により単一の胚体内胚葉への不可逆的分化方法が開発できた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】生体生命情報学

【研究領域課題番号】23650152 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 分化 / 数理モデル / 計算機シミュレーション / 安定性 / 細胞分化

【研究成果の概要】

本研究は、数理モデルを用いた解析を用いて、幹細胞の分化機構の理解することを目的とした。細胞分化を引き起こす制御ネットワークの探索を行うことによって、出現し得る分化過程のダイナミクスを網羅的に解析し、その過程における不可逆性や安定性の解析を行った。結果として、分化能を持つ幹細胞は振動する発現ダイナミクスを持つことを示し、それを生み出す制御ネットワークの性質の理解に成功した。それらの知見を基に、マウス初期胚における分化ダイナミクスを説明する数理モデルの構築を行った。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】22790730 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

DNAメチル化 / エピゲノム / 細胞特異的遺伝子発現 / 心筋細胞 / 転写調節 / 細胞種特異的遺伝子発現 / エピジェネティクス / 細胞分化 / ゲノムワイド / 次世代シークエンサー / 幹細胞 / バイオインフォマティクス

【研究成果の概要】

エピゲノム情報はその分化可能性を評価する指標となることが考えられるが、どのような領域のエピジェネティック状態が細胞の性質に影響しうるかは明らかでない。本研究では、細胞種に特徴的な未知のエピゲノム変化を探索し、幹細胞の分化可能性評価のためのエピゲノム情報基盤を整備することが目的である。本研究計画内において、申請者らは心筋細胞特異的なgene body領域の低メチル化状態を見出した。広範囲に渡る低メチル化状態は、転写およびエピジェネティック因子の蓄積を伴っており、細胞の特性に密接に関わるエピゲノムを形成する一因となる。本研究計画では、エピゲノム情報による幹細胞評価系の整備に重要な細胞特異的エピジェネティック状態を見出した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】16659196 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞分化 / 核移植 / クローン / リプログラミング / 幹細胞 / ES細胞 / 血管内皮細胞 / 神経堤細胞

【研究成果の概要】

前年度、ES細胞から血管内皮細胞に分化する諸段階の細胞をドナーとして除核マウス未受精卵に核移植を行い、その後の胚発生率がドナー細胞の分化とともに著しく低下することを見いだした。本年度は、ES細胞の未分化性維持に必須な因子であるOct4の発現動態に注目し、分化に伴うエピジェネティックな変化と核移植後のリプログラミングとの相関を解析すると同時に、体細胞核由来ES細胞(ntES細胞)の特性について検討した。ES細胞のOct4発現は、分化条件2.5日目で既に減少し、プロモーター領域のエピジェネティツクな変化はヒストンH3K9のメチル化→DNAの高メチル化の順に進んだ。核移植後の胚発生率はOct4の発現、ヒストンH3K9のメチル化の増加とともに低下し、DNAメチル化が変化する以前の段階でリプログラミングに対する感受性が変化する可能性が示唆された。一方、PECAM1+のES細胞由来の核移植後胚盤胞より新たにES細胞を樹立し、それらのntES細胞が血管細胞への分化指向性をもっているかどうか,分化方向の特性を有するのかを検討を行った。マーカー遺伝子の発現、胚葉体形成能にはドナーES細胞との間で差は見られなかった。さらに、血管内皮細胞、平滑筋細胞への分化効率はドナーES細胞と変わらず、ドナー細胞の特性が保持されていることを示す結果は得られなかった。以上から、核移植後のリプログラミングに対するドナー核の感受性は分化の初期にヒストン修飾の変化とともに低下すること、ntES細胞が樹立された場合、ドナー細胞による分化指向性への影響は明らかではなく、正常ES細胞と同等の分化能を有することが示唆された。核移植後のリプログラミングに対する感受性と細胞の可塑性、分化の可逆性との関連を検討することにより、細胞分化の新たな側面が明らかになると期待された。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】形態・構造

【研究領域課題番号】15570052 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 細胞移植 / 副腎皮質 / ステロイドホルモン / 細胞分化 / 器官形成 / 多能性幹細胞 / 細胞移動

【研究成果の概要】

哺乳動物の副腎は中胚葉由来の皮質と外胚葉由来の髄質からなる。両者は発生の過程で合流し一つの臓器を形成する。副腎皮質には、同心円状に存在する3種類の細胞層(球状層、束状層、網状層)が存在し、それぞれ層特異的に鉱質、糖質コルチコイドおよび副腎性アンドロゲンを生成する。これら細胞層に対して、皮質全層を貫いて放射状に並ぶ細胞群は、系譜を同一とする細胞の集団であることが示されている。しかし、細胞層構築のない胎生期の状態から、成熟組織に認められる放射状のクローナルな細胞集団の形成過程は明らかでない。
本研究は、ラット胎生期から機能分化細胞層の形成過程における細胞の配列・配置の機構を明らかにすることを目的とした。我々は、既に副腎皮質に未分化細胞層(zU)を確認しているが、「多能性の幹細胞を含む層である」を確実に証明するに至っていない。しかし、このzUと共通の性質を保持する細胞株樹立の成功はこの細胞株に高発現するAZ-1(adrenocortical zonation factor-1)の同定に繋がった。AZ-1の発現は球状層に存在する鉱質コルチコイド産生酵素の発現とは相関的に、束状層に存在する糖質コルチコイド産生酵素の発現とは逆相関的関係にあり、AZ-1は副腎皮質の層別機能局在を規制する因子の一つと考えられた。
更にAZ-1は、in situ hybridizationの結果からzG/zUで生合成されるが、免疫組織化学的には、球状層では細胞塊の周りにアーク状に、また、zFRでは東状の細胞配列に平行して存在する洞様血管に沿って局在することが判明した。AZ-1分子は、分泌シグナル配列の他に広義のEGF様配列、および触媒残基が置換したprocathepsin B様配列を有する。よって、AZ-1は、細胞と細胞外マトリックスとをつなぐ因子である可能性、あるいは、細胞外の基質分解に関与し、細胞の接着・運動を制御する因子である可能性も予測された。事実、AZ-1タンパクは副腎において細胞外マトリックスであるラミニンやコラーゲン、フィブロネクチンの局在とほぼ一致した。更に、胎生期後半から成熟期に至る副腎におけるAZ-1タンパクの局在は、常にラミニンの局在と類似して観察された。ラット胎仔期から成熟過程の副腎における血管系形成は、そのごく近辺に細胞外マトリックスの発現とAZ-1の発現を伴っていた。副腎皮質の三層は共に中胚葉由来ではあるが、zU付近で誕生する副腎皮質の未分化細胞は、細胞それぞれの最終分化までにAZ-1などの助けを借りながら血管系に沿った細胞の移動があるものと考える。今後、これらの確固たる裏付けが必須となる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】13680724 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

副腎皮質 / ステロイドホルモン / 細胞分化 / 組織形成 / 器官形成 / 幹細胞

【研究成果の概要】

副腎皮質は、異なるステロイドホルモンを産生する3種類の分化した細胞層を含む。我々は近年、齧歯類の成熟副腎皮質の球状層と束状層の間に、副腎皮質の幹細胞層と推定される細胞層を発見した。最近、この未分化細胞層と共通の性質を持ち、分化能を保持した細胞株を樹立した.未分化状態の副腎皮質細胞には、細胞の増殖・分化の制御に重要な分子が特異的に発現している可能性がある。そこで未分化細胞株に特異的な蛋白質の同定を行った結果、新しい分泌蛋白質(Adrenocortical zonation factor-1,以下AZ-1と記す)を同定した。この蛋白賞は、分泌シグナル、EGF様配列、プロカテプシンB様配列から構成された。mRNAの解析により、AZ-1の発現レベルは、副腎皮質における最終分化マーカーであるコルチコステロン合成酵素(Cyp11b-1)の発現レベルと逆相関することが判明した。この関係は、AZ-1のクローニングに用いたCyp11b-1の発現レベルの異なる細胞株群、Cyp11b-1を発現する細胞へAZ-1遺伝子の導入を行って得た細胞株群、副腎皮質組織の3種の系で成り立っていた。組織化学的な解析により、副腎皮質内でAZ-1は球状層で生合成・分泌され、全層の実質細胞の周囲に検出されることが判明した。AZ-1の局在は、細胞外マトリクス蛋白質のそれと一致した。一部の細胞外マトリクス蛋白質に対するAZ-1の結合を解析した結果、AZ-1は、フィブロネクチンとの結合能が判明した。AZ-1は他の臓器にも発現していることから、組織一般の形成、維持における本蛋白質の役割が解明されれば、組織損傷の治療法、がん細胞の増殖、転移の抑制の治療法等の開発のために本蛋白質の利用が考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】生物形態・構造

【研究領域課題番号】13640668 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 細胞移植 / 副腎皮質 / ステロイドホルモン / 細胞分化 / 器官形成

【研究成果の概要】

副腎皮質は、球状層、束状層、網状層と呼ばれる三層から構築される組織である。各層は異なる作用を持つステロイドホルモンを産生する。皮質全体として細胞の増殖、除去が定常的に行われる組織であるが、これまで幹細胞の同定はなされていない。近年、我々は球状層(zG)と束状層(zF)の間に、未分化でかつ増殖性を有する細胞からなる細胞層(zU)を見出した。そしてこの細胞層は多能性の幹細胞を含み、それが分化・増殖してzGとzFRの細胞を生じるとの仮説を提唱した。本研究は、この仮説を証明するため、副腎皮質から得られた単一クローンからなる未分化細胞集団を用い、この細胞から分化した副腎皮質細胞が生じるか否かを示すことを目的とした。
13年度は温度感受性SV40T抗原を発現するトランスジェニックマウス副腎から樹立した細胞株のうち、zU細胞と同様な性質を保持している上述の細胞株の性質を詳細に検討した。その結果、この未分化な細胞株に特異的に発現する新規分泌蛋白質を同定した。この蛋白質はN端から分泌シグナル、EGF様配列、プロカテプシンB様配列で構成され、間質性尿細管腎炎の抗原として同定されたウサギTIN-agと高い相同性がある。TIN-agは、細胞外マトリックス蛋白質として腎臓の尿細管の形成に重要であることから、本蛋白質も副腎皮質の形成に関与することが予測された。このzU細胞を移植に伴う拒絶反応のないscidマウスの腎臓被膜下に移植し副腎皮質の形成を試みたが成功には至っていない。14年度は新規分泌蛋白質の副腎内での役割を検討した。本蛋白質の発現ベクターをY-細胞株に導入するとY-1に存在するzFの機能マーカーであるP45011βの発現を抑制することが判明した。本蛋白質はadrenocortical zonation factor-1(AZ-1)と命名された。マウス副腎におけるAZ-1はzGおよびzUで生合成されるのに対し、転写産物である蛋白質は副腎皮質の全層、とくに血管構築に沿って認められたことから生合成と局在の部位が異なることも判明した。このzU細胞株はラミニンやコラーゲンIVを主成分とするMATRIGELの存在下ではT抗原の許容温度である33度でも分化し、zFマーカー遺伝子を発現した。AZ-1の細胞外マトリックス成分としての作用は副腎皮質三層の形成と維持に重要であると考えられる。現在、このzU細胞の個体へ移植を引続き試みるとともに、zU細胞株のzG細胞への分化を検討中である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】12307016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 骨髄 / 心筋細胞 / 再生 / 心不全 / 細胞分化 / 細胞移植 / 再生医学 / 骨髄細胞 / 発生

【研究成果の概要】

本研究では骨髄間質細胞を分化誘導することにより心筋細胞を作製し、心不全治療に応用しうるレベルに至るまでの基礎研究を行った。今回の一連の研究を通して、(1)骨髄中の多分化成体幹細胞を用いることにより心筋細胞が分化誘導できること、(2)この現象はマウスのみでなく、ヒトの骨髄成体幹細胞を用いても再現できること、(3)骨髄由来の心筋細胞は胎児期心室筋の表現型を取ること、(4)分化当初は洞結節型の活動電位を呈するが、分化とともに心室筋型の活動電位を呈すること、(5)交感神経α1受容体を発現し、心肥大作用を伝達すること、(6)交感神経神経β受容体を発現し、陽性変時作用、陽性変力作用を伝えること、(7)副交感神経ムスカリンM2受容体を発現すること、(8)蛍光色素GFPと心筋特異的プロモーターを使用することにより、心筋細胞のみを単離出来ること、(9)単離した再生心筋細胞を心臓内に移植すると、心臓内で長期間生着出来ること、(10)このような幹細胞は心筋梗塞などの心筋の壊死炎症がある状況では拘束部位に移動し、心筋やほかの細胞に分化する能力を持つこと、(11)ある種のサイトカインは骨髄から幹細胞の移動に積極的に働くこと、(12)幹細胞と心筋細胞の共培養は幹細胞の心筋分化を誘導する可能性のあること、(13)心筋分化能のある骨髄成体幹細胞の表面抗原はヒトとマウスで異なること、(14)ヒトの骨髄成体幹細胞はin vitroで長期間培養するとテロメアの長さの関係で細胞増殖できなくなるが、いくつかの遺伝子導入を行うことにより、細胞増殖できるようになることなどが明らかとなった。このことは骨髄成体幹細胞から分化誘導した心筋細胞は生体内の心筋とほぼ同等の性質を持ち、心筋細胞移植が一歩現実に近づいたことを意味するものである。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】43,500千円 (直接経費: 37,200千円、間接経費: 6,300千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12557096 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞増殖 / 細胞分化 / サイトカイン / 肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から純化された肝幹細胞画分であるc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞を回収し、これらのクローナルな培養系を用いて、肝細胞および胆管細胞への分化誘導能を有する新規サイトカインのスクリーニングを行うことを目的として研究を行った。肝幹細胞から胆管細胞への分化誘導能を有する培養上清を得て、さらに、この培養上清の特定分子量分画にc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞の増殖抑制活性が限定的に存在することを確認した。この分子量分画から活性タンパク・ペプチドの精製を試みたが、結果として培養液中の血清の存在が困難要因となり精製には至らなかった。一方、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞に与える既知の各種サイトカイン、細胞外マトリックス、転写因子C/EBPsの影響に関するスクリーニング解析により、hepatocyte growth factor(HGF)やC/EBPsが肝幹細胞の初期分化に重要な役割を果たしていることを明らかにした(Development 130:2513-2524,2003)。
今後、肝幹細胞の分化・増殖機構を精度の高い解析系を用いて、ひとつひとつ丹念に検証していくとともに、実用化技術の開発に向けた疾患モデル動物における治療効果についても並行して検討する必要がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】9,800千円 (直接経費: 9,800千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】12470030 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

副腎皮質 / ステロイドホルモン / 細胞分化 / 組織形成 / 器官形成 / 幹細胞

【研究成果の概要】

哺乳動物の副腎皮質は、球状層、束状層、網状層の3層から成る。我々は、近年3層に加えて、球状層と束状屈の間に未分化な細胞層(未分化細胞層)を見い出した。その後の解析から、未分化細胞層は、多能性の幹細胞を含み、分化・増殖して球状層と束状眉の細胞が生じるとの仮説を提唱した。12年度は、温度感受性SV40T抗原遺伝子をトランスジーンとして持つマウス副腎から、未分化細胞冠と同様な分化形宜を示す細胞株AcA101を樹立した。未分化細胞株AcA101は、非許容温度でdibutyryl cAMPの存在下で培養することにより、束状層マーカー遺伝子の発現が誘導されることが判明した.従って、未分化な状態から、束状屈様に分化することが判明した。未分化細胞株に加えて、束状層細胞様に分化した形質を示す細胞株も得られた。
未分化状態の副腎皮質細胞には、細胞の増殖・分化の制御に重要な分子が発現している可能性がある。13年度には、未分化細胞株に高発現し、分化した細胞に低発現する遺伝子の同定を行った。その結果、新しい分泌蛋白質を同定した。この蛋白質は、EGF様配列、プロカテプシンB様配列から構成された。このような構造から、本蛋白質が、細胞外における情報伝達、細胞外基質等の分解に関与することが推定された。本蛋白質を束状層様の細胞株に発現させ、分化状態を解析したところ、束状層の分化マーカー遺伝子(コルチコステロン合成における最終段階の酵素)P45011betaの発現が抑制された。この結果は、新規蛋白質の発現により、細胞層特異的なステロイド合成酵素遺伝子の発現が抑制されることを示す。従って、未分化細胞株から同定した新しい分泌蛋白質は、in vitroで最終分化形質を抑制しうることを示す。本蛋白質は、他の臓器にも発現しており、今後の研究により組織一般の形成、維持における役割の解明が重要と思われる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】14,500千円 (直接経費: 14,500千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】10680621 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

副腎皮質 / ステロイドホルモン / 細胞分化 / 器官形成 / 幹細胞 / 組織形成

【研究成果の概要】

哺乳動物の副腎皮質はそれぞれ鉱質コルチロイド、糖質コルチロイド、および副腎性アンドロゲンを分泌する球状層、束状層、網状層の3層からなる。我々は、これら3層に加えて、球状層と束状層の間に皮質の幹細胞を含むと思われる未分化な細胞層(以下、未分化細胞層)を近年新たに見いだし、未分化細胞層から分化・増殖して、球状層と束状層の細胞が生じるとの仮説を提唱した。この仮説を証明するため、最近我々は未分化細胞層の性質を持つマウス副腎皮質細胞株を樹立するに成功した。
10年度は、未分化な状態を保っている細胞株に特異的に発現している蛋白質のcDNA単離を試み、転写調節蛋白質、転写コファクター、細胞間マトリクス蛋白質と相同性のある蛋白質をコードするcDNAを複数単離した。これらは、遺伝子の発現調節、細胞間相互作用に関与することから、発生・分化に重要な役割を持ちうる分子であることが期待される。
11年度は、これらの分子の細胞内発現部位の同定および、機能解析を進めた。これらのmRNAの発現を、マウスの主な臓器から調整したRNAを用いてノザン解析した。その結果に基づき、副腎での発現量が多い分子2種について、in situ hybridizationにより組織内発現分布を解析した。一方は、未分化細胞層から球状層に局在した。他方は、未分化細胞層から束状層外側に局在した。さらに、このような局在と皮質細胞のステロイドホルモン産生機能、および、増殖能の関連を調べるため、層機能マーカー分子の局在、および、DNA合成細胞の分布を免疫組織化学的に解析した。その結果、2種の分子の局在は、それぞれ、球状層細胞の分化・増殖、および、束状層細胞の分化・増殖が活発な部位とよく一致することが判明した。以上の結果は、これらの分子が副腎皮質組織の形成・維持に関与していることを示す。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07409001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカン / サイトカン受容体 / シグナル伝達 / 造血 / アポトーシス / 分化 / RAS / STAT / サイトカイン / サイトカイン受容体 / 血管内皮 / 発生 / 誘導遺伝子 / 細胞分化 / 造血因子 / JAK / Ras / 幹細胞 / 造血細胞 / 増殖 / 細胞死 / キナーゼ / 細胞増殖

【研究成果の概要】

IL-3/GM-CSF/IL-5受容体の変異体を使ったシグナルの解析からRASとSTAT5という二つの主要なシグナル伝達経路が明らかになってきたので、これらの活性化とサイトカイン機能との関連を中心に研究を展開した。造血細胞はその増殖だけでなく、生存にもサイトカインによる刺激を必要としており、RASの活性化は造血細胞においては細胞死の抑制に重要であることを明らかにした。さらに、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していること、またサイトカイン除去による細胞死にもcaspaseが関与することなどを明かにした。一方、多くのサイトカインはSTAT5を活性化するが、その生理的意義を明らかにするために、STAT5誘導性遺伝子の分離を行い、SH2ドメインをもつ新規シグナル分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatin M(OSM)などを同定した。CISはサイトカインのシグナルをnegativeに制御する分子であることを示した。優勢抑制型のSTAT5変異体を用いた実験から、STAT5が造血細胞の細胞あるいは赤芽球分化に重要な機能をもつことを明らかにした。さらに、STAT5とRASによるシグナル経路がクロストークすることも示した。STAT5誘導遺伝子として同定されたOSMの機能の検索を行い、胎生期での血球発生過程や生殖細胞などに作用があることを示した。また、遺伝子クローニングによりOSM受容体の分子構造も明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1998

【配分額】36,500千円 (直接経費: 36,500千円)