【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】16659196 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞分化 / 核移植 / クローン / リプログラミング / 幹細胞 / ES細胞 / 血管内皮細胞 / 神経堤細胞

【研究成果の概要】

前年度、ES細胞から血管内皮細胞に分化する諸段階の細胞をドナーとして除核マウス未受精卵に核移植を行い、その後の胚発生率がドナー細胞の分化とともに著しく低下することを見いだした。本年度は、ES細胞の未分化性維持に必須な因子であるOct4の発現動態に注目し、分化に伴うエピジェネティックな変化と核移植後のリプログラミングとの相関を解析すると同時に、体細胞核由来ES細胞(ntES細胞)の特性について検討した。ES細胞のOct4発現は、分化条件2.5日目で既に減少し、プロモーター領域のエピジェネティツクな変化はヒストンH3K9のメチル化→DNAの高メチル化の順に進んだ。核移植後の胚発生率はOct4の発現、ヒストンH3K9のメチル化の増加とともに低下し、DNAメチル化が変化する以前の段階でリプログラミングに対する感受性が変化する可能性が示唆された。一方、PECAM1+のES細胞由来の核移植後胚盤胞より新たにES細胞を樹立し、それらのntES細胞が血管細胞への分化指向性をもっているかどうか,分化方向の特性を有するのかを検討を行った。マーカー遺伝子の発現、胚葉体形成能にはドナーES細胞との間で差は見られなかった。さらに、血管内皮細胞、平滑筋細胞への分化効率はドナーES細胞と変わらず、ドナー細胞の特性が保持されていることを示す結果は得られなかった。以上から、核移植後のリプログラミングに対するドナー核の感受性は分化の初期にヒストン修飾の変化とともに低下すること、ntES細胞が樹立された場合、ドナー細胞による分化指向性への影響は明らかではなく、正常ES細胞と同等の分化能を有することが示唆された。核移植後のリプログラミングに対する感受性と細胞の可塑性、分化の可逆性との関連を検討することにより、細胞分化の新たな側面が明らかになると期待された。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】16390507 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脂肪吸引 / 幹細胞 / 脂肪由来幹細胞 / SVF / CD34 / CD105 / 血管内皮細胞 / CD31 / 脂肪幹細胞 / 血管新生 / 組織増大 / 間質細胞 / 細胞外マトリックス / 細胞療法

【研究成果の概要】

脂肪吸引手術による吸引物(元来、生理食塩水、血液、脂肪組織破砕物からなる)は浮遊する脂肪部分と下層の液体成分に分けることが可能である。脂肪部分由来の細胞をprocessed lipoaspirate(PLA)細胞、液体部分由来の細胞をliposuction aspirate fluid(LAF)細胞と呼ぶ。どちらも組織、液体を処理して採取した細胞群をstromal vascular fractions(SVF)と呼ぶ。両部分より採取したSVFを新鮮状態で、また培養して、その細胞群の性質を調べた。ほぼ同等数のLAFとPLA cellsが採取されたが、接着培養するとLAFの方が有意に少なかった。新鮮LAF細胞から採取したCD34+CD45-細胞を接着培養すると細胞の増殖が観察され、LAFには脂肪由来幹細胞(ASC)が含まれていることが示唆された。新鮮細胞の状態ではPLAとLAFは非常に異なる細胞表面マーカーを示すが、培養後の接着細胞は非常に似通った細胞増殖能、形態、分化能、細胞表面抗原発現を示した。接着培養すると、PLA細胞もLAF細胞もCD29,CD44,CD49d,CD73,CD90,CD105,CD151の発現する細胞の割合が増え、CD31、Cn45の発現する細胞の割合は減少した。Multicolor FACSによる分析により、新鮮SVFは不均一な細胞集団であることがわかり、血液由来細胞群(CD45+)、ASC (CD31-CD34+CD45-CD90+CD105-CD146-),血管内皮細胞(CD31+CD34+CD45-CD90+CD105lowCD146+),血管周細胞(CD31-CD34-CD45-CD90+CD105-CD146+)、その他の細胞で構成されていることがわかった。接着培養を始めると、ASCはCD105の発現が劇的に増加した。ASCsは細胞培養により時間の経過とともにCD34発現を失う細胞が増えたが、われわれの細胞培養法においてはCD34を少なくとも10-20週間は維持することが可能であった。これらの結果は脂肪吸引物由来の細胞が細胞療法において有用であることを示唆している。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】13,900千円 (直接経費: 13,900千円)

【研究分野】血液内科学

【研究領域課題番号】14657241 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

造血幹細胞 / 可塑性 / ヒトES細胞 / 血球細胞 / Tie2 / GFP / 再生医療 / 幹細胞 / 再生医学 / Notch / paraaortic-splanchnopleura(P-SP)領域 / 血管内皮細胞

【研究成果の概要】

GFPトランスジェニックマウス造血幹細胞分画を移植して、脳内からGFP陽性細胞を採取し、神経特異的マーカーであるNeuNやTrk-Rの発現を解析した。この実験では、脳内においてGFP陽性細胞を同定することができ、これらの細胞におけるNeuNおよびTrk-Rの発現を確認した。しかしながら、その発現時期を明確にすることはできなかったため、これらの分子の発現を誘導する転写因子の道程には至らず、したがって遺伝子発現プロファイルを解析し、幹細胞可塑性の分子メカニズムを解明するという当初の目標に到達することはできなかった。
しかし一方申請者らは、科学技術・学術審議会「特定胚及びヒトES細胞研究専門委員会」において、ヒトES細胞の研究計画について審議を受け、平成14年12月に文部科学大臣からの計画承認を受けた。その後、ヒトES細胞の培養に着手し、造血細胞をよりよく分化誘導する条件を検索している。現在までのところ、無血清条件で未分化状態を保ちながらヒトES細胞を維持できているが、血球細胞への分化については血清添加条件でのみ成功している。これと同時に、マウスES細胞を用いて、ES細胞から造血幹細胞への分化を決定する分子を、発現クローニング法により同定を試みている。すなわち、ES細胞にTie2プロモーターでドライブされるGFP発現ベクターを導入し、GFP陽性をESから造血幹細胞への分化方向中胚葉マーカーとして用いる。マウスAGM由来cDNA発現ライブラリーをOP-9ストローマ細胞に導入し、ES由来GFP発現細胞の出現を指標として、cDNAを単離することを試みる。このようにして、別な角度から再生医療への道筋を見いだしたいと考えている。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】13877110 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

臍胎血 / 心筋細胞 / 分化誘導 / 血管内皮細胞 / 再生医学 / 多能性幹細胞 / 心不全 / 細胞移植 / 発生分化 / 幹細胞 / 臍帯血

【研究成果の概要】

【目的】臍帯血より心筋分化能を有する可能性のある細胞を単離し、増殖し、分化誘導を試みた。【方法】(1)臍帯血よりauto MACSを用いて、CD45陰性、CD29陽性、CD34陰性、CD44陽性の細胞群を単離し、ファイブロネクチン塗布培養皿上に接着させた。(2)この細胞を培養し、細胞の増殖曲線を作成した。(3)この細胞の表面抗原をFACS解析した。(4)この細胞をインスリン存在下で培養し、脂肪細胞への分化を観察した。(5)この細胞を0.1mMデキサメサゾン、0.05mMアスコルビン酸-2リン酸、10mMβ-グリセロフォスフィト存在下で培養し、骨芽細胞への分化を観察した。【結果】(1)臍帯血より上記表面抗原の抗体を利用することにより、付着系の間葉系幹細胞が回収できた。この細胞はin vitroである程度増殖させることが可能であった。(2)増殖曲線は一週間で3倍程度の増加速度であった。(3)インスリン存在下ではこの細胞は脂肪細胞に分化した。(4)デキサメサゾン、アスコルビン酸-2リン酸、β-グリセロフォスフィト存在下ではこの細胞は骨芽細胞に分化した。フォンコッサ染色陽性の細胞が観察された。【結論】臍帯血細胞中には間葉系の幹細胞が存在した。この細胞が心筋細胞に分化するかはさらなる研究が必要と考えられた。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)