【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】26460934 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

胃食道接合部 / 癌 / 幹細胞 / 分化誘導

【研究成果の概要】

胃食道接合部は扁平上皮細胞と円柱上皮細胞が境界部を形成し悪性腫瘍の発生頻度が高いが、発生機序については不明である。我々は胃食道接合部に特異的に発癌するモデルを作成し、胃食道接合部癌の起源と発癌機序を検討した。胃粘膜特異的にKRAS遺伝子とTGFbR2遺伝子に変異を導入すると、約6週で扁平上皮円柱上皮接合部(SCJ)に浸潤性の腫瘍が発生し、扁平上皮、腺上皮、幹細胞の形質を示した。腫瘍細胞株からオルガノイドを作成し、検討したところ、Wntリガンド、EGF、Nogginなどから独立した生存条件を示した。KRT19陽性、Lgr5陰性の細胞が接合部癌の起源となっている可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】眼科学

【研究領域課題番号】26893262 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

涙腺再生 / 分化誘導 / 合成mRNA / ドライアイ / 涙腺 / 転写因子 / 幹細胞 / 再生医療

【研究成果の概要】

涙腺は眼表面に涙液を分泌し、眼表面を保護する。現状の涙腺機能不全に対する治療は、人工涙液による対症療法であり、重症瘢痕性角結膜疾患において重度に障害された涙腺機能の再建のために、涙腺再生医療の実現が求められている。本研究では、幹細胞からの転写因子発現制御による涙腺上皮細胞の誘導を目指して、涙腺器官形成能を持つマウス涙腺原基上皮細胞の細胞特性を明らかとした。さらに、マウスにおいて成体涙腺や涙腺に類似した器官を用いて網羅的遺伝子解析を行うことにより、涙腺発生過程において涙腺原基上皮特異的に発現する遺伝子群を解析し、幹細胞からの涙腺上皮誘導に重要と考えられる転写因子群を同定した。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2014-08-29 - 2016-03-31

【配分額】2,990千円 (直接経費: 2,300千円、間接経費: 690千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】24390097 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生殖細胞 / 多能性 / 幹細胞 / 分化誘導 / ES細胞 / EG細胞 / iPS細胞 / シグナル / 相互転換

【研究成果の概要】

生殖細胞は次世代を作ることができる唯一の細胞系列である。生殖細胞は、培養条件下でES細胞と同等の分化多能性幹細胞へ初期化されることから、潜在的に多能性を持つ細胞である。本研究では、試験管内でES細胞から生殖細胞を作る研究と、生殖細胞を多能性幹細胞へ初期化させる研究を行った。まず、生体内では、生殖細胞は中胚葉細胞とともに分化することに着目し、ES細胞の中胚葉分化誘導系を用いて、試験管内で胎仔期の生殖細胞に似た細胞を作ることに成功した。次に、生殖細胞の初期化機構を、シグナル伝達や小分子化合物を用いて解析し、体細胞からiPS細胞への初期化と共通の機構があることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】18,720千円 (直接経費: 14,400千円、間接経費: 4,320千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】15390452 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

胚性幹(ES)細胞 / 骨分化 / 軟骨分化 / 分化十分条件 / 培養方法 / 再生医学 / 骨 / 軟骨 / 再生 / 胚性幹細胞 / 分化誘導 / 幹細胞 / 胚性幹細胞(ES)

【研究成果の概要】

ラットI型コラーゲン遺伝子プロモーター下流にGFPを付けたトランスジーンを発現するマウス、マウスII型コラーゲン遺伝子プロモーター下流にGFPを付けたトランスジーンを発現するマウスを、それぞれ野生型のマウスと交配させて胚盤胞を分離し、そこからES細胞を樹立した。また、上記トランスジーンを発現するレトロウイルスを作成し、これを野生型ES細胞に感染させて株を樹立した。これらのES細胞は、骨芽および軟骨細胞に分化したときにのみ蛍光を発するので、分化誘導因子のスクリーニングに細胞センサーとして利用した。骨芽分化誘導因子としては、BMP受容体、Hhのシグナル伝達分子であるSmo、Wntの転写因子であるLEF-1、Runx2の発現アデノウイルスを作成し、上記ES細胞センサーに網羅的に組み合わせて加え、Runx2とBMPシグナルの組み合わせが相乗的に強力に骨芽細胞分化を誘導することを見出した。軟骨分化誘導因子としては、BMPおよびSoxシグナル伝達系をES細胞センサーに加え、Sox9と、Sox5あるいはSox6の組み合わせが強力に軟骨分化を誘導することを見出した。これらの実験により、骨芽あるいは軟骨細胞分化誘導のシグナルの最適化を行った。
また、樹立したES細胞を、最適条件で分化させることなく、平面培養で増殖させるための至適条件(継代のタイミングと、コロニーサイズ)を決定した。さらに将来ヒトES細胞を使うことを睨んで、カニクイザルのES細胞を購入し、これを用いて培養・分化方法について経験を積んだ。
上記のごとく決定した至適条件で分化した骨芽様細胞および軟骨様細胞を、それぞれアテロコラーゲンフィルム上に播種して培養し、十分な基質をつくらせ、基質の石灰化及び、トルイジンブルー染色でのメタクロマジーを確認した。このシートを骨・軟骨欠損モデルマウスの欠損部に移植し、移植後1〜4ヵ月後に麻酔後屠殺し、移植部分を組織学的、免疫組織学的に観察したところ、骨欠損のマウスにおいては、良好な再生誘導が見られたが、軟骨欠損に関しては、有意な治癒効果が見られなかった。この原因としては、軟骨分化誘導刺激がまだ十分に最適化されていない可能性が考えられ、今後他のシグナル経路との組み合わせを考慮してスクリーニングしていく予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】13877110 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

臍胎血 / 心筋細胞 / 分化誘導 / 血管内皮細胞 / 再生医学 / 多能性幹細胞 / 心不全 / 細胞移植 / 発生分化 / 幹細胞 / 臍帯血

【研究成果の概要】

【目的】臍帯血より心筋分化能を有する可能性のある細胞を単離し、増殖し、分化誘導を試みた。【方法】(1)臍帯血よりauto MACSを用いて、CD45陰性、CD29陽性、CD34陰性、CD44陽性の細胞群を単離し、ファイブロネクチン塗布培養皿上に接着させた。(2)この細胞を培養し、細胞の増殖曲線を作成した。(3)この細胞の表面抗原をFACS解析した。(4)この細胞をインスリン存在下で培養し、脂肪細胞への分化を観察した。(5)この細胞を0.1mMデキサメサゾン、0.05mMアスコルビン酸-2リン酸、10mMβ-グリセロフォスフィト存在下で培養し、骨芽細胞への分化を観察した。【結果】(1)臍帯血より上記表面抗原の抗体を利用することにより、付着系の間葉系幹細胞が回収できた。この細胞はin vitroである程度増殖させることが可能であった。(2)増殖曲線は一週間で3倍程度の増加速度であった。(3)インスリン存在下ではこの細胞は脂肪細胞に分化した。(4)デキサメサゾン、アスコルビン酸-2リン酸、β-グリセロフォスフィト存在下ではこの細胞は骨芽細胞に分化した。フォンコッサ染色陽性の細胞が観察された。【結論】臍帯血細胞中には間葉系の幹細胞が存在した。この細胞が心筋細胞に分化するかはさらなる研究が必要と考えられた。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】13470151 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

心筋細胞 / 骨髄間葉系幹細胞 / 分化誘導 / 再生医学 / 幹細胞 / CD抗原 / 細胞移植 / 骨髄 / 表面抗原 / FACS / 多分化能 / 多能性幹細胞 / 心不全 / 発生分化 / 間葉系幹細胞 / 細胞増殖因子 / サイトカイン

【研究成果の概要】

【目的】骨髄血より心筋分化能を有する可能性のある細胞を単離し、増殖し、分化誘導を試みた。
【方法】(1)骨髄血よりauto MACSを用いて、CD45陰性、CD29陽性、CD34陰性、CD44陽性の細胞群を単離し、ファイブロネクチン塗布培養皿上に接着させた。(2)この細胞を培養し、細胞の増殖曲線を作成した。(3)この細胞の表面抗原をFACS解析した。(4)この細胞をインスリン存在下で培養し、脂肪細胞への分化を観察した。(5)この細胞を0.1mMデキサメサゾン、0.05mMアスコルビン酸-2リン酸、10mMβ-グリセロフォスフィト存在下で培養し、骨芽細胞への分化を観察した。(5)この細胞を既知の種々の増殖因子で刺激し、心筋分作を観察した。
【結果】(1)骨髄血より上記表面抗原の抗体を利用することにより、付着系の間葉系幹細胞が回収できた。この細胞は,in vitroである程度増殖させることが可能であった。(2)CD29陽性、CD45陰性、CD44陽性、CD34陰性、CD13陰性、CD49e陽性であった。(3)インスリン存在下ではこの細胞は脂肪細胞に分化した。(4)デキサメサゾン、アスコルビン酸-2リン酸、β-グリセロフォスフィト存在下ではこの細胞は骨芽細胞に分化した。フォンコッサ染色陽性の細胞が観察された。(5)この細胞はIGF-1,FGF, TGFb, LIF, EGF, PDGF,エンドセリンでは心筋分化の誘導活性は無かった。しかし、Wntにより心筋特異的転写因子の一部が誘導された。
【結論】骨髄血細胞中の間葉系幹細胞はある種の増殖因子により心筋分化が誘導されると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】16,400千円 (直接経費: 16,400千円)

【研究分野】熱工学

【研究領域課題番号】12555060 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自己組織性 / 組織工学 / 細胞培養 / バイオメカニクス / 胆管形成 / バイオ人工肝臓 / 肝細胞 / 細胞コロニー / 幹細胞 / 分化誘導

【研究成果の概要】

細胞を用いたバイオ人工肝臓の実用化のためには,生体外において三次元細胞組織モジュールを構築する必要がある.ラットの肝臓には,幹細胞の一種と考えられる増殖能力の強い肝細胞が存在する.この小型肝細胞と名付けられた細胞を分離して非実質細胞と共培養すると,肝組織に類似した三次元構造が構築される.
小型肝細胞は,培養後2週間ほど経つと非実質細胞に囲まれたコロニーを形成し,一部の細胞は成熟化し形態的に盛り上がってくる盛り上がった肝細胞間には白い筋状の構造が形成され,培養後3〜4週間ほどで複雑に繋がったネットワーク構造を形成する.
今回我々は,この白い筋状に見える毛細胆管様構造が生体内と同様の極性を保持しているか否か検討した.また,位相差顕微鏡でのタイムラプス撮影により毛細胆管の収縮運動について解析し,再生された毛細胆管に対するEndothelin-1とA23187の収縮運動への影響について検討した.
本実験系において再形成された毛細胆管は管状のネットワーク構造を形成し,それらが協調して収縮運動を行なうことが分かった.毛細胆管の長さ方向に細胞10〜20個分の距離が離れていても,少なくとも20秒以内に同期して収縮を開始していることが分かる.また,このように急激に収縮するタイプの毛細胆管運動は,細胞1個分の長さのみが収縮することはほとんどなく,細胞数個分に渡って同期して収縮することが多い.
この毛細胆管収縮運動の協調作用は,ギャップ結合を介したシグナル伝達によって調節されていると考えられる.毛細胆管収縮のセカンドメッセンジャーである[Ca^<2+>]_iやIP_3は,肝細胞のギャップ結合を介してシグナルを伝達することができる.本研究における再形成毛細胆管においても細胞間にギャップ結合タンパク質であるコネクシン32,26の発現が認められている.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】13,500千円 (直接経費: 13,500千円)