【研究分野】法医学

【研究領域課題番号】24590858 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

薬剤 / 突然死 / 心筋症 / マウス / Chlorpromazine / Apoptosis / Heart / Mouse / Human / 心臓突然死

【研究成果の概要】

精神病薬服薬患者の心臓突然死は、法医剖検にて有意な所見が得られないため、 突然死の病態解明に苦慮する。マウス心臓を標的臓器として抗精神病薬であるChlorpromazine (Chl)を動物モデルに長期投与することにより、不整脈・心筋症を発症させうる遺伝子発現状態を確認した。本研究では、培養細胞・心筋組織について、Chl処置を行った心筋組織にて核のクロマチン凝集が認められ、Tunel法で陽性であった。ヒトにおいても同様に認められた。 従って、Chlは心筋にApoptosisを生じさせることが判明した。 このことから、長期Chl投与は心筋症を生じさせるものと推定する 。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】24591924 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

テネイシンC抗体 / マンゴスチン / 乳癌 / 転移 / 治療 / マウス / 抗体医薬 / 複合治療 / テネイシン / 抗腫瘍効果 / α-マンゴスチン / アポトーシス / 血管新生 / リンパ管侵襲 / テネイシン抗体

【研究成果の概要】

乳癌細胞株をマウス皮下に移植し、2週間後にテネイシンＣ（TNC）抗体（125μg、週2回, 腹腔内投与）、α-マンゴスチン（4000 ppm, 混餌投与）並びに両者の組み合わせ投与を実施し、６週経過後に実験を終了した。腫瘍体積では、対照群と比較して、全ての治療群で１週より実験終了まで抑制をみた。病理組織学的には、リンパ節および肺転移を含む総て臓器の転移において、対照群と比較して、全ての治療群で有意な低下をみた。以上、本乳癌モデルに対して、TNC抗体あるいはα-マンゴスチンは腫瘍増殖および転移に対する抑制作用を発揮したが、両者を複合することによる明らかな抗腫瘍作用の増強効果は示されなかった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】基礎獣医学・基礎畜産学

【研究領域課題番号】16108003 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

受精 / 体細胞初期化 / 卵巣特異的遺伝子 / 卵母細胞の死滅 / 卵母細胞の生存促進 / 卵子 / 卵胞 / ヒアルロン酸 / CD44 / マクロファージ / VEGF / GDF-9 / マウス / ミニブタ体細胞クローン / 遺伝子改変マウス / Cx43 / アポトーシス / Oct4 / 受精能 / 卵胞発育 / 卵胞閉鎖 / CD44 antigen glycosylation / 未成熟卵子凍結保存法(SWEID) / Connexin 43 / TAP発現ベクター / GDF-9遺伝子 / 体細胞初期化能 / ミトコンドリア置換 / FLIP / iRNA法 / ES細胞 / ギャップ結合構成コネクシン遺伝子

【研究成果の概要】

1個体からの受精可能卵子の大量生産を目標として卵子の細胞分化・死滅の調節系の解明を行い、新規調節因子を同定するとともに、これを踏まえ受精能・体細胞初期化能高発現卵子生産などの技術を開発した。さらに、直径70μm未満のマウス卵胞卵子由来の産子や家畜ブタ体外成熟卵子をレシピエントとする体細胞ミニブタ作出に成功した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2004 - 2008

【配分額】104,520千円 (直接経費: 80,400千円、間接経費: 24,120千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】15100007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ / ショウジョバエ / 遺伝学 / 神経発生 / IAPファミリー / イメージング / キナーゼ / プロテアソーム / 神経細胞死 / ショウジョウバエ / 神経変性 / タンパク質分解 / アポトーシス / JNK / 蛋白質分解 / 神経細胞 / 細胞死 / 発生 / マウス / 細胞選択

【研究成果の概要】

ショウジョウバエ遺伝子の過剰発現スクリーニング(GSスクリーニング)を取り入れることで、神経細胞死シグナルの機能的的ゲノムスクリーニングを行った。ポリグルタミンによる神経細変性に関与する遺伝子として小胞体に存在する不良品蛋白質の輸送チャネル(Sec61α)を同定した。Sec61αは、分泌経路で合成される蛋白質の小胞体への移行と、小胞体関連タンパク質分解Endoplasmic Reticulum Associated Degradation : ERADにおいて小胞体から細胞質への不良品タンパク質の輸送を担う重要なチャネルである。Sec61αをショウジョウバエ複眼や培養細胞で過剰発現すると不良品タンパク質が細胞質に逆輸送されて蓄積し細胞死が誘導されること、逆にSec61αの活性を遺伝学的に弱めることによりポリグルタミン病モデルにおいて細胞質に蓄積していた不良品タンパク質が減少し、晩発性の神経変性が回復することが明らかになった。さらに、GSスクリーニングによって、神経細胞死シグナルを発する候補遺伝子としてDmIKKεが得られた。遺伝子の機能欠損スクリーニングによってもDmIKKεが得られ、細胞死を誘導しないレベルのカスパーゼ活性を調節することを見いだした。細胞死シグナルに関与する遺伝子のスクリーニングからDmIKKεが得られたことをふまえてその基質を探索した結果、種を超えて保存されたカスパーゼ抑制因子DIAP1が同定された。DmIKKεはDIAP1をリン酸化することによってその分解を促進する。DmIKKεを生体でノックダウンすると内在性のDIAP1レベルが組織で上昇した。しかし、この状態でも発生過程での細胞死は正常におこり、ここでのDmIKKεによるDIAP1レベルの調節は細胞死以外の生理機能に関与することが示唆された。本研究が明らかにした段階的なカスパーゼ活性化による神経選択の新たな仕組みは、発生と神経変性での細胞運命決定機構に新たな視点をもたらしたものである。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2003 - 2006

【配分額】119,080千円 (直接経費: 91,600千円、間接経費: 27,480千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】13358012 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA干渉 / RNAi / siRNA / ヒト / マウス / 有効siRNA配列 / ウェブサイト / off-target / 遺伝子機能破壊 / 哺乳類 / 全ゲノム遺伝子 / RNA干渉法 / Dicer / eIF2C1 / インターフェロン / ヒトゲノム / 哺乳類培養細胞 / ds RNA / SiRNA / ルシフェラーゼ / アポトーシス

【研究成果の概要】

RNAiは、二本鎖RNA(dsRNA)を細胞に導入し塩基配列特異的に遺伝子機能を破壊する方法で、ポストゲノム・シーケンス時代の網羅的遺伝子機能破壊法として注目されている。哺乳類においては、dsRNAによるapoptosisを避けるために21bpからなるsiRNAが長いdsRNAの変わりに用いられてきた。
我々は、はじめに、哺乳類におけるsiRNA依存的RNAiに、eIF2C1-4及びDicerが必要であり、これらのタンパク質がeIF2CのPIWIドメインを介して相互作用する事を明らかにした。次いでヒトやマウスの遺伝子機能解明をゲノムワイドで実施する上で問題となるsiRNA法の問題点、即ちランダムに設計したsiRNAのおよそ80%は役にたたないという問題にチャレンジし、それを実際的に克服する方法を見出した。内容の詳細は、発表論文に譲るが、有効なsiRNAは、4つの条件を同時にみたしており、これらは、少なくとも部分的にsiRNAのRISCへの取り込みとsiRNAの変性の過程に依拠していると推定された。コンピュータをも知多解析から、ヒトやマウスのほとんど全ての遺伝子に有効なsiRNAが設計できることが分かり、ここで開発した手法で求めたsiRNAの配列を用いて、ヒトマウスのほとんどの遺伝子の機能かは異がかのうであることが分かった。良く効くsiRNA配列は、細胞内で、配列の類似している別の遺伝子由来のmRNAを破壊するかもしれない。この効果をoff target効果という。off target効果を最小にするコンピュータプログラムをコンピュータ科学の専門家(東京大学大学院新領域研究科・森下真一教授)との共同研究でつくり、最適siRNAを、投入した任意の配列に対してコンピュータで素早く応答するweb site (siDirect)を構築した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】34,710千円 (直接経費: 26,700千円、間接経費: 8,010千円)

【研究分野】応用獣医学

【研究領域課題番号】08456158 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プリオン / マウス / ジーンターゲッティング / 遺伝子 / アポトーシス / プロモーター / アデノウイルス / PCR

【研究成果の概要】

白オリックスプリオン遺伝子に特異的なプライマーを使ったPCR法によりオリックスプリオン蛋白質翻訳領域を含むDNA断片を増幅し、TA-cloning vectorにサブクローニングした。オリックスプリオン蛋白質を過剰発現するマウス作成のため、外来遺伝子の全身での発現を強力に誘導するβ-アクチンプロモーターの支配下にオリックスプリオンcDNAを組み込んだ(pActin-oPrp)(図参照)。得られるトランジェニックマウスでは脳、免疫細胞、筋肉などを含むすべての臓器で外来遺伝子の発現が期待される。実際に我々は既にCT2(分泌蛋白)を同β-アクチンプロモーターの支配下に組み込んだトランジェニクマウスを作成し、すべての臓器におけるCT2の発現をノーザンブロット法により確認し、さらにCT2モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法によりトランスジェニクマウス血清中におけるCT2蛋白質の存在を確認している。完成したプラスミッド(pActin-oPrp)は制限酵素Sal IおよびHind IIIで処理され、ベクター配列が除かれた後、Gene clean kitを用いて精製された。現在、得られたトランスジーン断片をアイクロインジェクション法によって、BDF1マウスの受精卵に導入している。20日後には仔が生まれ、さらに4週後には成熟したマウスの尾よりDNAを回収し外来遺伝子の存在を確認する予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】7,700千円 (直接経費: 7,700千円)

【研究分野】発生生物学

【研究領域課題番号】07780664 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プログラム細胞死 / 線虫 / プロテアーゼ / ICE / マウス / アポトーシス

【研究成果の概要】

1)細胞死遺伝子の活性を調節する細胞外情報伝達物質
細胞死は様々な細胞外のシグナルによって調節されていて、最終的には細胞死実行遺伝子Ice/ced-3ファミリーの活性が調節されていると考えられる。細胞外からIGEの活性化を調節する因子の検索を行い、細胞傷害性のサイトカインTNFがIGEの活性化を引き起こすことを明らかにした。逆に、ICE活性化を阻害する因子としてICE-1を同定した。ICE-1は発生と密接に関係のある栄養因子であり、ICE活性の調節による細胞の生存維持効果が示唆された。
2)細胞死遺伝子産物に結合する因子の検索
ICEの活性発現には前駆体蛋白質P45のP20とP10へのプロセッシングが必要であるが、このプロセッシング機構については不明な点が多い。また、ICEファミリーによる細胞死を抑制するBCL-2ファミリーは様々な細胞質因子と相互作用することによって細胞死抑制機能を発揮する例が示されている。酵母を用いたtwo-hybrid systemを用いてICE/CED-3ファミリー、BCL-2/CED-9ファミリーと複合体を形成する蛋白質をcDNAライブラリーよりスクリーニングし、細胞死実行に関与するICE/CED-3ファミリーの活性化につながる経路を明らかにしようと試みた。Iceの発現が確認されている細胞である、Iymphoma,HeLa細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングに用いた。X-Galを用いた検出法で約100万個のHeLacDNAライブラリーの中から2つのオーバーラップする、Iceと結合すると考えられるクローンが得られている(4E、10F)。ced-3に関しては100万個の1ymphoma cDNAライブラリから2クローン(3T-1,3T-3)、ced-9に関しては10万個のIymPhoma cDNAライブラリーから1クローン(9T-4)positive cloneが得られた。現在全長のcDNAクローニングと、哺乳類細胞でのinter actionを調べている。また、線虫のホモログのクローニングも進めている。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1995

【配分額】1,100千円 (直接経費: 1,100千円)