【研究分野】物理化学

【研究領域課題番号】16H04094 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

１分子イメージング / １分子観察 / 低温顕微鏡 / 抗原抗体反応 / １分子計測(SMD) / 一分子観察 / １分子観察(SMD) / 共焦点顕微鏡 / 生体分子 / 生物物理 / 化学物理

【研究成果の概要】

タンパク質は複合体をつくり生理機能を発現している。当該課題の研究目的は、その分子間相互作用を１分子観察できる光イメージング法を確立することにある。このような試みは世界的に見ても誰も成功していない。それは、分子間相互作用を研究するには、解像度1 nmで三次元全ての軸に対する空間情報を取得しなければならないからである。
このような背景から我々は、ナノメートルの分解能のクライオ蛍光顕微鏡の開発に取り組んだ。その結果、昨年、短い二本鎖DNAの両末端（長さ10 nm）を光で１分子観察することに成功した。また、分子間相互作用の観察のプラットフォームとなる非天然アミノ酸を用いた蛍光標識に成功している。

【研究の社会的意義】

当該研究は数nm～100 nmの長さを観察するという顕微鏡における空白領域を埋めるものであり、学術的にも社会的にも大きな意義があると考えている。さらに、分子間相互作用は長い間その意義が指摘されながらも研究が難しい対象であった。よって、当該研究は将来的にとてもおおきな可能性をもっていると考えられる。今後は、この顕微鏡を応用し、細胞内や生体組織内における観察を可能にすることで、医学・薬学に貢献したいと考えている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2020-03-31

【配分額】16,900千円 (直接経費: 13,000千円、間接経費: 3,900千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】15H04358 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

１分子計測（SMD） / ナノバイオ / 蛋白質 / １分子計測（SMD) / 光ピンセット / リボソーム / １分子生理学・生化学 / １分子イメージング / ナノ計測 / １分子計測(SMD)

【研究成果の概要】

１．蛍光標識したmiRNA前駆体を細胞内にマイクロインジェクションし、内在性の生合成経路によりRISCに取り込ませた。ゴルジ体を中心にアクチンフィラメント上を動くmiRNAを１分子イメージングできた。
２．Cy5標識アンチセンスプローブを用いてストレス下の細胞内mRNAの局在を超解像イメージングした。ストレス顆粒（SG）内でmRNAは均一に存在するのではなく、直径約100 nmの高密度領域を形成していた。
３．SecMのリボソーム外の領域を部分的に欠損させた変異体の翻訳アレストの寿命を測定した。57-73と57-98番目のアミノ酸が翻訳アレストの安定化に寄与していた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】16,120千円 (直接経費: 12,400千円、間接経費: 3,720千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】23750182 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / 細胞・組織 / 生体分子 / 1 分子計測(SMI) / 生体関連化学 / 機能性分子 / 光制御 / 1分子イメージング / シグナル伝達 / 蛋白質 / 1分子計測（SMD）

【研究成果の概要】

本研究では、細胞内シグナル伝達における受容体クラスター形成の意義の理解を目的とした。この目的のため、シグナル伝達分子Aktの1分子動態観察と、受容体ナノクラスターの人工的形成法の開発を行った。前者では、細胞外からのシグナル入力により、Aktの細胞膜滞在時間が延びることを見出した。この結果は、Akt動態が細胞表面の受容体クラスターに影響されることを示している。後者では、光感応性タンパク質を融合した受容体および精製タンパク質の構築に成功し、クラスター形成の光制御を実現する道具の準備を整えた。以上のように、本研究では受容体クラスターがシグナル伝達に重要な機能を果たしていることを示し、その重要性を構成的に証明する礎を築いた。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】ナノ材料・ナノバイオサイエンス

【研究領域課題番号】22241032 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

1分子イメージング / ナノ計測 / １分子計測 / 放射光 / ナノバイオ / X線 / 1分子計測 / X線集光 / 分子内運動

【研究成果の概要】

2000年に大型放射光施設を用いたX線1分子追跡法(DiffractedX-rayTracking:DXT)を提案し、それ以来、ポリマーやDNA分子、抗原抗体反応、そして機能性膜タンパク質と分子内運動をマイクロ秒からミリ秒レベルで、かつピコメートルという超高精度で高速1分子計測してきた。この高精度1分子追跡法を実験室レベルで計測可能とする装置開発を行い汎用的手法として確立させることが本研究の目的である。実現のための技術的ポイントは3つある。直径100-800nmサイズの完全ナノ結晶作製技術の確立、デモ的な実験室レベルX線光源として放射光施設を用いての高効率集光化、そして、究極的信号バッググラウンドの低減対策を放射光施設で実現した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】44,980千円 (直接経費: 34,600千円、間接経費: 10,380千円)

【研究分野】ナノ材料・ナノバイオサイエンス

【研究領域課題番号】20510114 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

1分子イメージング / ナノ計測 / 1分子操作 / ナノ流体デバイス / 電気インピーダンス測定 / マイクロ化学システム / MEMS / NEMS / 1分子科学 / 分子操作 / ナノ界面・表面 / ナノバイオロジー / 1分子・ナノ計測 / 1分子計測 / マイクロ・ナノデバイス / ナノバイオ / システムオンチップ

【研究成果の概要】

本研究は,幅や高さが数10nmサイズのナノ流路を利用して,生体分子を1分子ずつ検出する1分子センシングデバイスを実現するために必要な要素技術の開発を目的としてスタートした。その結果,ナノ流路内でfAオーダーの感度を持つ電流計測系の構築に成功し,ナノ流路内での超高感度電流測定から,ナノ流路を流れるDNA1分子の検出に成功した。さらに,オンチップ型のfA級電流測定回路の集積化にも成功し,集積化1分子計測ナノ流体システムの構築を一歩進めることに成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】10480185 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

1分子技術 / 1分子計測 / 1分子イメージング / 1分子捕捉 / 生体分子モニター / アクチン・ミオシン / ルースカップリング / 分子機構 / 生体分子モーター / プローブ顕微鏡 / 1分子操作 / 分子間相互作用

【研究成果の概要】

生体分子の分子構造解明を目的として、生体分子1個を活性を保持したまま捕まえ操作する新しい技術を開発した。水溶液中で分子1個を蛍光顕微鏡により直接観察するために、対物レンズ型全反射照明による蛍光1分子イメージング法を開発した。タンパク質を活性を保持したまま表面に固定するため、アビジン・ビオチン系を使う方法を確率した。化学修飾できる先鋭な探針先端として、先端の曲率半径が約17nmのZnOウィスカーを用いた。
この方法で微小ガラス針先端に捕捉したミオシン頭部1分子が、アクチン・フィラメントと相互作用して進む様子を直接計測することができた。ATP存在下での相互作用により台形状の変位が引き起こされるが、この立ち上がり部分を解析したところ、ミオシン頭部がステップ状にアクチン上を動くのが発見された。ATP濃度や温度を変えても、ステップ状の変位が観察された。統計的に解析したところ、ステップの大きさは平均5.3mmであった。わずかではあるが、逆向きステップも確認された。1変位あたり1〜5回のステップを踏んでいて、平均で2.5ステップしていることがわかった。
ステップの時間間隔の平均は、1μMATPで5ms、0.1μMの時3msとなって誤差の範囲で一致し、ATP濃度に対して依存性がなかった。また、台形状変位とATP分解が1:1に対応すると仮定すると、台形状変位の継続時間と、溶液中で測定されたアクチン・ミオシンとATP結合の2次の反応定数が一致した。このことから、ミオシン頭部1分子が,1回のATP加水分解中に複数回の力学的ステップを行うことが結論づけられた。
この新しい1分子捕捉計測技術は、分子間相互作用を1分子で直接計測するものであり、分子機構解明のための画期的な計測法である。また当研究の結果は、確率的な分子機構であるルースカップリング説の直接証拠を、初めて提示するものである。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】13,100千円 (直接経費: 13,100千円)