【研究分野】応用微生物学

【研究領域課題番号】18108002 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

麹菌 / タンパク質分泌 / タンパク質生産 / エンドサイトーシス / 小胞体ストレス / 細胞工場 / 緑色蛍光タンパク質 / オートファジー / プロテアーゼ遺伝子破壊 / 発酵生産 / 光変換型蛍光タンパク質 / プロテアーゼ / αアミラーゼ / カルネキシン / マイクロアレイ解析 / RNAi / Aspergillus oryzae / 分泌ストレス / 可視化 / EGFP

【研究成果の概要】

麹菌(Aspergillus oryzae)は日本酒、醤油、味噌などの醸造に使用されている重要な微生物であり、大量に酵素などのタンパク質を分泌生産する能力を持つ。最近、解読された全ゲノム情報を利用してタンパク質の分泌経路に関して、分子生物学的及び細胞生物学的手法により解析を行った。これにより得られた成果に基づいて遺伝子破壊や突然変異株の単離などの手法により有用タンパク質を多量に生産する麹菌の育種に成功した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2006 - 2010

【配分額】112,060千円 (直接経費: 86,200千円、間接経費: 25,860千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】17657069 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

オートファジー / リソソーム / 酸性コンパートメント / タンパク質凝集体 / LC3 / ミクロオートファジー / 可視化 / pH感受性蛍光色素

【研究成果の概要】

本課題では哺乳類細胞を用いて、客観性のあるオートファジーの定量的評価方法を開発することを目的としている。昨年度から試みているpH感受性色素(CypHer5)で細胞質からリソソームへの移動を追跡する方法を今年度さらに検討を重ねた。CypHer5をBSAやIgGなどのタンパク質に共有結合させ、これを細胞質にマイクロインジェクションした。その結果、リソソームへの移動がかなり抑制されたが依然としてマクロオートファジー非依存的にリソソームへ到達してしまうことが結論された。現在ワルトマニンなどのPI3K阻害剤などを用いて、ミクロオートファジーの関与などをさらに追求している。
現在のオートファジーの定量的解析の問題点のひとつとして、オートファジーの理想的な阻害方法がないことがあげられる。そこで、私たちはAtg5ノックアウトマウスに由来する線維芽細胞を利用して、テトラサイクリンによる遺伝子誘導系を利用して、「突然」オートファジー能を欠損あるいは回復できる細胞株を作製した。例えばこれを用いることによってオートファジーは通常の培地で培養している限り細胞の大きさにはほとんど影響しないが、栄養飢餓による細胞萎縮には正の関与をしていることなどを明らかとした。
また現在多くの研究においてLC3というオートファゴソーム膜タンパク質の挙動でオートファジーの活性が評価されているが、LC3の標識が真のオートファゴソームを示すだけではなく、単なるタンパク質凝集に非特異的に含まれてしまう場合があることに気がついた。そこでこの方法の問題点と対応策についても論文発表を行った。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)