【研究分野】発生生物学

【研究領域課題番号】16K07365 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生 / ゼブラフィッシュ / 幹細胞 / トランスジェニック / Cre-loxP / 位置情報 / 鰭 / 細胞系譜 / 組織再生

【研究成果の概要】

生物は、からだを長期に維持，再生する能力＝組織恒常性を持つが、このメカニズムはほとんど明らかになっていない。イモリや魚類などは四肢や鰭を再生することができるが，この過程の研究から，組織恒常性の秘密が解明できることが期待される。
本研究では，ゼブラフィッシュ尾ヒレの再生における細胞の振る舞いについて研究を行い，以下の成果を得た。（1）皮膚，骨を再生する過程では，組織に保存されている組織幹細胞が重要な役割を果たす。（2）炎症は再生に必要であるが，過剰の炎症は再生細胞の死を起こす。マクロファージは細胞の生存を助けている。（3）組織の最終サイズや形を決める情報が存在し，長期に安定な性質を持つ。

【研究の社会的意義】

イモリや魚類などは，失った四肢や鰭を完全に再生することが古くから知られている。この驚くべきメカニズムは，近年，急速に分子的な背景の解明も進んできたが，再生における細胞の振る舞いは解明が遅れていた。本研究は，皮膚と骨について，細胞の再生過程を解明し，組織にある幹細胞の重要性を示した。またさらに，炎症やマクロファージの再生における役割も示し，形や大きさがどのように再生されるかについても，位置情報の存在を示すことに成功した。
このような再生過程の解明から、ほ乳類で再生能力が限定されている原因や、いかにして組織が一定に保たれているか、さらに幹細胞から組織，器官を作る技術へと繋がることが期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】天然資源系薬学

【研究領域課題番号】15H04650 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 天然物 / タンパク質ビーズ / ヘッジホッグ / ノッチ / Hes1 / 神経分化 / タンパク質 / 再生 / ケミカルバイオロジー

【研究成果の概要】

本研究では幹細胞に働き，再生医薬のリードとなり得る天然物を，天然物エキスライブラリーから見いだすことを目的とした．標的タンパク質ビーズを用いる「標的タンパク質指向型天然物単離法」として，bHLH転写因子Hes1，ヘッジホッグ(Hh)シグナルの転写因子GLI1，ノッチ(Notch)シグナルの転写因子NICDを担持したタンパク質ビーズを用い，それぞれに結合し生物活性を有する天然物を見いだした．また，細胞アッセイを用いuscharin 等のNotchシグナル阻害剤を見いだした．

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】26253023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

炎症 / 再生 / 線維化 / サイトカイン / イメージング / 肝炎 / 胆管 / 肝臓 / 肝障害 / 肝細胞 / 間葉系細胞 / 幹細胞 / 免疫

【研究成果の概要】

種々の病因による肝炎から肝幹／前駆細胞の活性化を介した再生応答を、肝臓構成細胞間の相互作用に着目して解析を行った。炎症により肝前駆細胞の活性化を伴う胆管増生は胆管の増殖を伴うリモデリングであることを細胞系譜解析および肝臓の３次元構造の可視化法により示した。さらに、増殖性の胆管細胞は胆管の末端部に局在すること、増殖を始めた細胞の運命はstochasticに決まることを見いだした。また、肝臓でのサイトカインの過剰発現による新規肝線維化モデルを開発し、線維化誘導機構の一端を明らかにした。IL-4過剰発現により特徴的なNK細胞が出現することを見いだしその性状解析を行った。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】40,820千円 (直接経費: 31,400千円、間接経費: 9,420千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】25670754 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生 / 皮膚 / 未分化 / 幹細胞 / 毛包

【研究成果の概要】

細胞凝集塊形成による未分化性獲得のメカニズムに迫ることを目的とした。マウス線維芽細胞凝集塊形成により、未分化マーカーの上昇を認めた。しかしこれらは、作成したクローンの中でバラツキがあり、単一の細胞から分裂した線維芽細胞であっても、細胞塊を形成する段階で、周囲環境の違いにより、さまざまな未分化マーカーの発現の差異を生じることが判明した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2013-04-01 - 2015-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】22249011 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

発生 / 再生 / 肝炎 / 線維化 / 細胞増殖 / サイトカイン / 細胞分裂 / 細胞肥大 / 細胞周期 / FGF / 幹細胞 / 肝障害 / ニッチ

【研究成果の概要】

肝臓は再生能を備えたユニークな臓器として知られている。本研究では、肝臓の一部を切除した後の肝再生においては、肝細胞が肥大することが重要であることを示し、従来の再生モデルに大幅な修正を加えた。また、炎症を伴う肝障害においては、しばしば門脈域に肝前駆細胞の出現することが知られている。本研究により、肝前駆細胞の出現にはFGF7が必要であること、肝前駆細胞の出現が肝障害からの回復に重要であることを明確にした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】48,620千円 (直接経費: 37,400千円、間接経費: 11,220千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】21700423 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

緑内障 / 網膜神経節細胞 / 幹細胞 / iPS細胞 / 幹細胞生物学 / 再生 / 修復

【研究成果の概要】

緑内障の再生医療を念頭に、iPS細胞から網膜神経節細胞および成体における網膜幹細胞であるミューラー細胞を分化誘導する方法の確立、網膜内のミューラー細胞の同定法の探索を行った。まずiPS細胞からの分化誘導を行うために、網膜前駆細胞マーカーであるRx遺伝子座に赤色蛍光タンパク質DsRedが発現する組換えBACを作成しipS細胞に安定導入した。また、ミューサー細胞を同定するためにマーカーを探索し、エピプラキンが該当することを見いだした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】17209053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / 子宮筋 / 幹細胞 / 動物モデル / 再生医学 / 子宮内膜症 / 免疫不全マウス / 再生

【研究成果の概要】

本研究では、子宮内膜、子宮平滑筋といった雌性生殖器官における成体幹細胞システムの基礎的解明とともに、臓器再生と疾患モデル構築の技術開発という応用面に重点を置いて、以下の3点について研究を進めた。以下がその成果の概要である。
A.雌性生殖器官組織における幹細胞の分離・同定および幹細胞特性の解明
Side population(SP)法を用いて、子宮内膜と子宮平滑筋からSP細胞を純化・精製する方法を確立し、それぞれが未分化状態にあることに加えて、自己増殖能や多分化能といった幹細胞様特性を有することを明らかにした。
B.雌性生殖器官幹細胞を用いた臓器構築とその再生医療への応用
ヒト子宮筋より分離したSP細胞は、重度免疫不全マウス子宮においてヒト子宮筋を構築する能力を有することを示した。さらに、同マウスの腎被膜下に少数のヒト内膜分散細胞を移植することにより、ユニークな血管新生を伴い、且つホルモン反応性変化を呈する内膜組織が再構築されることを示した。さらに、その再構築内膜の振る舞いを、蛍光・発光蛋白マーカーを用いて、非侵襲的リアルタイムに観察可能なシステムを構築し、内膜再生モデルとしての有用性を示した。
C.雌性生殖器官幹細胞を用いた疾患モデルの構築
上記のヒト内膜再生モデルマウスは、内膜症モデルマウスとしてのポテンシャルを有しており、内膜症の発症・進展メカニズムの解明や内膜症治療薬の開発において有用な研究ツールになる可能性を示した。
内膜細胞あるいはその幹細胞から胚受容能を有するヒト内膜組織を再構築しin vitro着床システムの確立を目指しているが、その実験ツールとして、ヒト絨毛細胞株スフェロイド(胚に相当)と内膜腺上皮株を用いたin vitro着床モデルを確立した。また、着床に必須の内膜分化を担う分子メカニズムを明らかにし、それを標的にした着床制御に必要な基盤データも得た。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】49,920千円 (直接経費: 38,400千円、間接経費: 11,520千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】17209043 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 糖尿病 / 膵島 / 再生

【研究成果の概要】

最近、膵島移植が臨床的に確立してきたことから、膵臓を対象とした再生医学の進展に大きな期待が集まりつつある。特に未分化な幹細胞や前駆細胞を分離した後、その分化・増殖を制御することにより、膵β細胞を人為的に創出しようとする試みに期待が集まっている。しかしながら、他の組織と同様、膵臓に幹細胞や前駆細胞が存在するのか、存在するのであれば何処に局在するのかという問いに対する明確な答えは出ていない。そこで、本研究では膵管上皮に特異的な細胞表面分子の発現を指標として、高い増殖能と多分化能を兼ね備えた膵幹/前駆細胞をフローサイトメトリー(FACS:fluorescence activaied cell sorting)を用いて分離し、その局在部位が膵管上皮であることを明確化した。すなわち、膵臓において膵管上皮細胞に特異的に発現していることが知られているサイトケラチン7(CK7)の発現を指標として、CK7陽性細胞に共発現している細胞表面分子としてCD133を同定し、その発現を指標としてフローサイトメトリーで分離したCD133+CD34-CD45-Ter119-細胞画分に限定的かつ高頻度にクローン性コロニー形成能を有する細胞が含まれていることを明らかにした。これらのクローン性コロニーにおける各種細胞分化マーカーの発現解析では、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンなどの膵内分泌細胞マーカー、アミラーゼなどの膵外分泌細胞マーカー、サイトケラチン7などの膵管上皮細胞マーカーを発現した細胞がそれぞれ存在することが確認されたことから、CD133+CD34-CD45-Ter119-細胞は複数の異なった膵細胞系列に分化することのできる多分化能を有していることが明らかとなった。本研究により、高い増殖能と多分化能を兼ね備えた膵幹/前駆細胞が膵管上皮中に存在することが明確化された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】49,530千円 (直接経費: 38,100千円、間接経費: 11,430千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】16659340 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 再生 / 三次元培養 / 高次組織 / 微小重力

【研究成果の概要】

本研究では、多分化能と自己複製能を有する幹細胞の微小重力環境における三次元培養系を確立することにより、幹細胞から分化する複数の細胞群の「組織化」のメカニズムを解明するとともに、長期間にわたり高次機能を発揮可能な「組織」を再構築する新規培養技術を開発することを試みた。すなわち、組織幹細胞等の細胞を米国航空宇宙局(NASA)とシンセコン社が共同開発した微小重力環境に類似した培養条件(無対流・無ズリ力)を設定可能な回転培養装置(Rotating Wall Vessel Bioreactor : RWV)を用いて、幹細胞の分化や増殖をサポートする支持細胞との三次元共培養を試みた。マウス胎児肝臓から単離した細胞群を対象として、機能的な肝小葉構築を再現可能な三次元培養系の検証を行った結果、5x10^6個の胎児肝細胞をRWVを用いて5-10日間の三次元培養を行ったところ、胆管構造・血管構築などの高次組織構造を人為的に再構成できることが判明した。これらの再構成された胆管構造や血管構造には基底膜構造が適切に再構築されており、分岐管状構造も再現されていた。成熟肝細胞機能に関与する遺伝子発現レベルは、二次元培養系(ディッシュ培養)と比較して概して良好であった。肝細胞機能として重要なアンモニア分泌能やアンモニア代謝能も有していることが判明し、三次元的組織構造が細胞分化を支持することが示唆された。今後、より機能の高い高次組織構造を創出可能な三次元培養系の開発を行う必要がある。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】15390452 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

胚性幹(ES)細胞 / 骨分化 / 軟骨分化 / 分化十分条件 / 培養方法 / 再生医学 / 骨 / 軟骨 / 再生 / 胚性幹細胞 / 分化誘導 / 幹細胞 / 胚性幹細胞(ES)

【研究成果の概要】

ラットI型コラーゲン遺伝子プロモーター下流にGFPを付けたトランスジーンを発現するマウス、マウスII型コラーゲン遺伝子プロモーター下流にGFPを付けたトランスジーンを発現するマウスを、それぞれ野生型のマウスと交配させて胚盤胞を分離し、そこからES細胞を樹立した。また、上記トランスジーンを発現するレトロウイルスを作成し、これを野生型ES細胞に感染させて株を樹立した。これらのES細胞は、骨芽および軟骨細胞に分化したときにのみ蛍光を発するので、分化誘導因子のスクリーニングに細胞センサーとして利用した。骨芽分化誘導因子としては、BMP受容体、Hhのシグナル伝達分子であるSmo、Wntの転写因子であるLEF-1、Runx2の発現アデノウイルスを作成し、上記ES細胞センサーに網羅的に組み合わせて加え、Runx2とBMPシグナルの組み合わせが相乗的に強力に骨芽細胞分化を誘導することを見出した。軟骨分化誘導因子としては、BMPおよびSoxシグナル伝達系をES細胞センサーに加え、Sox9と、Sox5あるいはSox6の組み合わせが強力に軟骨分化を誘導することを見出した。これらの実験により、骨芽あるいは軟骨細胞分化誘導のシグナルの最適化を行った。
また、樹立したES細胞を、最適条件で分化させることなく、平面培養で増殖させるための至適条件(継代のタイミングと、コロニーサイズ)を決定した。さらに将来ヒトES細胞を使うことを睨んで、カニクイザルのES細胞を購入し、これを用いて培養・分化方法について経験を積んだ。
上記のごとく決定した至適条件で分化した骨芽様細胞および軟骨様細胞を、それぞれアテロコラーゲンフィルム上に播種して培養し、十分な基質をつくらせ、基質の石灰化及び、トルイジンブルー染色でのメタクロマジーを確認した。このシートを骨・軟骨欠損モデルマウスの欠損部に移植し、移植後1〜4ヵ月後に麻酔後屠殺し、移植部分を組織学的、免疫組織学的に観察したところ、骨欠損のマウスにおいては、良好な再生誘導が見られたが、軟骨欠損に関しては、有意な治癒効果が見られなかった。この原因としては、軟骨分化誘導刺激がまだ十分に最適化されていない可能性が考えられ、今後他のシグナル経路との組み合わせを考慮してスクリーニングしていく予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】14207046 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膵臓 / 再生 / 幹細胞 / 糖尿病

【研究成果の概要】

「膵再生」による糖尿病治療の臨床応用に向けた基盤技術の開発を目的として、単離した膵細胞集団の中から、極少数しか存在せずかつ形態によって区別することが難しい多能性を持つ膵幹細胞(pancreatic stem cell)を、FACS(fluorescence activated cell sorter)を用いた精度の高い細胞分離法により純化・回収し、それらの分化・増殖・自己複製機構を解析することを試みた。マウス新生児膵臓より分離したc-Met+Flk-1-c-Kit-CD45-TER119-細胞中に、高い増殖能と複数の膵細胞系列への多分化能を兼ね備えた膵幹/前駆細胞が限定的かつ高頻度に存在すること、さらにそれらがin vivoにおける組織再構築能を有することを確認した。一方、細胞分化の可塑性を利用した手法として、マウス胎児腸管上皮細胞を分化誘導因子を添加して培養し、RT-PCR、免疫染色法によりインスリン発現を検討した。その結果、膵・細胞の分化誘導作用を有するglucagon like peptide-1(GLP-1)(1-37)に、インスリン発現誘導作用があることが明らかになった。腸管上皮細胞由来のインスリン産生細胞は、培養液中にインスリンを分泌しており、グルコース応答性を有することが判明した。妊娠マウスへの投与実験でも、GLP-1(1-37)は胎児腸管上皮におけるインスリン産生細胞の分化誘導作用を有することが確認された。さらに、インスリン産生細胞を誘導した腸管組織を糖尿病マウスの腹腔内に移植したところ、血糖値降下作用や体重減少抑制作用などの治療効果が観察された。すなわち、腸管上皮細胞の可塑性を利用することにより、膵外組織において異所性にインスリン産生細胞を誘導することが可能であり、糖尿病に対する再生医学的アプローチとして期待がもてると考えられた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】43,680千円 (直接経費: 33,600千円、間接経費: 10,080千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】13877371 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 神経細胞 / アポトーシス / 歯状回 / 顆粒細胞 / 再生 / 再生医療 / 神経細胞分化 / 骨髄間質細胞 / 倫理 / 細胞周期 / cAMP / シナプス形成

【研究成果の概要】

本研究の開始直前に、数ヵ所の研究室から造血幹細胞の神経細胞への転換に成功したという報告が相次いでなされたが、どの報告においても率が低く、電気生理学的解析を含めた解析は不十分であった。そこで、我々は造血幹細胞からの薬剤(cAMP上昇を持つ薬剤)誘導型の転換を追試し、各種神経マーカーの発現を確認(追試)した上で電気生理学的解析を行った。しかしながら、細胞の状態が悪く、解析に耐えうる状態ではないうえ、形態的にアポトーシス様のものが散見されたため、方向性を転換し、保護的に作用する薬剤のスクリーニングを行った。まず、死の様式がアポトーシス性のものである可能性をカスパーゼ3の上昇で確認した。その上で細胞周期の制御がかかわっているという仮説のもとにcdc kinase阻害剤olomoucineに、カスパーゼ上昇抑制の効果を見いだした。現在、再現性の確認と実際の細胞死への保護作用を検討中である。
研究の一方で、発展が著しい分野であるため国内の関連研究室の協力発展が不可欠と考え、薬学会シンポジウムにおいて造血幹細胞・臍帯血中幹細胞を応用している主要な研究者(大串、室原、出澤、高橋、各氏)を招待し相互交流を深めた。
加えて、生体内での神経細胞の自然な再生のメカニズムを解明することが医療応用にもつながるという観点から、海馬の歯状回に存在する神経幹細胞が常に生まれ変わり、正常な投射を行い、機能的に活動する仕組みについても広く研究を行った。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】1,900千円 (直接経費: 1,900千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】12307016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 骨髄 / 心筋細胞 / 再生 / 心不全 / 細胞分化 / 細胞移植 / 再生医学 / 骨髄細胞 / 発生

【研究成果の概要】

本研究では骨髄間質細胞を分化誘導することにより心筋細胞を作製し、心不全治療に応用しうるレベルに至るまでの基礎研究を行った。今回の一連の研究を通して、(1)骨髄中の多分化成体幹細胞を用いることにより心筋細胞が分化誘導できること、(2)この現象はマウスのみでなく、ヒトの骨髄成体幹細胞を用いても再現できること、(3)骨髄由来の心筋細胞は胎児期心室筋の表現型を取ること、(4)分化当初は洞結節型の活動電位を呈するが、分化とともに心室筋型の活動電位を呈すること、(5)交感神経α1受容体を発現し、心肥大作用を伝達すること、(6)交感神経神経β受容体を発現し、陽性変時作用、陽性変力作用を伝えること、(7)副交感神経ムスカリンM2受容体を発現すること、(8)蛍光色素GFPと心筋特異的プロモーターを使用することにより、心筋細胞のみを単離出来ること、(9)単離した再生心筋細胞を心臓内に移植すると、心臓内で長期間生着出来ること、(10)このような幹細胞は心筋梗塞などの心筋の壊死炎症がある状況では拘束部位に移動し、心筋やほかの細胞に分化する能力を持つこと、(11)ある種のサイトカインは骨髄から幹細胞の移動に積極的に働くこと、(12)幹細胞と心筋細胞の共培養は幹細胞の心筋分化を誘導する可能性のあること、(13)心筋分化能のある骨髄成体幹細胞の表面抗原はヒトとマウスで異なること、(14)ヒトの骨髄成体幹細胞はin vitroで長期間培養するとテロメアの長さの関係で細胞増殖できなくなるが、いくつかの遺伝子導入を行うことにより、細胞増殖できるようになることなどが明らかとなった。このことは骨髄成体幹細胞から分化誘導した心筋細胞は生体内の心筋とほぼ同等の性質を持ち、心筋細胞移植が一歩現実に近づいたことを意味するものである。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】43,500千円 (直接経費: 37,200千円、間接経費: 6,300千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12557096 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞増殖 / 細胞分化 / サイトカイン / 肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から純化された肝幹細胞画分であるc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞を回収し、これらのクローナルな培養系を用いて、肝細胞および胆管細胞への分化誘導能を有する新規サイトカインのスクリーニングを行うことを目的として研究を行った。肝幹細胞から胆管細胞への分化誘導能を有する培養上清を得て、さらに、この培養上清の特定分子量分画にc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞の増殖抑制活性が限定的に存在することを確認した。この分子量分画から活性タンパク・ペプチドの精製を試みたが、結果として培養液中の血清の存在が困難要因となり精製には至らなかった。一方、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞に与える既知の各種サイトカイン、細胞外マトリックス、転写因子C/EBPsの影響に関するスクリーニング解析により、hepatocyte growth factor(HGF)やC/EBPsが肝幹細胞の初期分化に重要な役割を果たしていることを明らかにした(Development 130:2513-2524,2003)。
今後、肝幹細胞の分化・増殖機構を精度の高い解析系を用いて、ひとつひとつ丹念に検証していくとともに、実用化技術の開発に向けた疾患モデル動物における治療効果についても並行して検討する必要がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】9,800千円 (直接経費: 9,800千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12307023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 肝臓 / 幹細胞 / 再生

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から肝幹/前駆細胞画分であるc-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞を選別・回収する技術を確立した。さらに、肝幹細胞の純化を進め、胎児肝臓中の僅かに0.3%を占めるにすぎないc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞中に限定的に肝幹細胞が存在することを明らかにした。そして、このc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞は、多分化能を維持したまま増殖可能で自己複製能を有していること、膵細胞や腸管上皮細胞など他の細胞系列の細胞へ分化する可塑性を有していることなどを明らかにした。これらのc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞が有する特性は、この細胞が厳密に定義し得る多能性肝幹細胞であることを如実に示している。これは、今まで概念としてしか捕らえられていなかった肝幹細胞の実体を初めて明確にしたという点で、幹細胞生物学的に意義の深い研究成果であったといえる。また、応用科学的側面からは肝幹細胞の分離・操作の基盤技術が確立されたといえ、今後の先進医療への応用が期待できる研究成果である。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】21,310千円 (直接経費: 19,000千円、間接経費: 2,310千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】11877192 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学 / 自己修復能

【研究成果の概要】

単離した肝細胞集団の中から、多能性を持つ肝幹細胞をFACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた細胞分離法により濃縮・純化し、それらの機能解析を行うことを目的として研究を行った。昨年度までの研究により、c-Kit-CD49f+CD29+ CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能の高いコロニー形成能を有した細胞が存在し、肝細胞と胆管細胞という異なる細胞系列へと分化し得ることを明らかにした(Hepatology 32(6):1230-1239,2000.)。今年度は、c-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞の画分化を段階的にすすめ、自己増殖能をも備えた幹細胞画分を明らかにすることを試みた。その結果、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能、多分化能、自己複製能、組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞(hepatic stem cell)が高頻度に存在することが判明した。また、この肝幹細胞の少なくとも増殖にhepatocyte growth factor(HGF)が必須の因子であることを明らかにした。今後、さらに、純化した肝幹細胞の分化・増殖・自己複製機構を培養系を用いて解析し、「臓器再生」の基盤となる知見および技術を確立する予定である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】10770579 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 幹細胞 / 分化 / 増殖 / 自己複製 / 肝細胞 / 胆管細胞 / liver / regeneration / organogenesis / stem cell / cell growth / differentiation

【研究成果の概要】

単離した肝細胞集団の中から、多能性を持つ肝幹細胞をFACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた細胞分離法により濃縮・純化し、それらの機能解析を行うことを目的として研究を行った。まず、in vitro肝幹細胞機能解析系の確立を目的として、マウス胎仔肝細胞の培養系を検討し、1個の細胞を始点とするクローン性コロニーを効率よく誘導可能な培養条件を決定した。そして、このコロニー形成能を指標として、FACSとモノクローナル抗体により画分化したマウス胎仔肝から単離した細胞群の解析を行った。その結果、胎仔肝中の非血球画分であるCD45^-TER119^-細胞から段階的に画分化を進め、最終的にc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞中に限定的、かつ、高頻度に増殖能の高いコロニー形成能を有した細胞が存在することが判明した。さらに、それらのクローン性コロニーを拾い上げRT-PCRおよび免疫染色法による細胞系列マーカーの発現の検討を行った。その結果、肝細胞マーカーと胆管細胞マーカーの発現を共に確認した。すなわち、1個のc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞から肝細胞と胆管細胞という異なる系列の細胞が分化し得ることを明確に証明した。また、FACSにより分離したc-Kit^-CD49f^+CD29^+CD45^-TER119^-細胞は、in vivoにおいても肝組織再構築能を有することを細胞移植により確認した。これらの結果は、マウス胎仔肝臓中のc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞は、高い増殖能、多分化能、組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞(hepatic stem cell)であることを示唆する。すなわち、本研究により、精度の高い肝幹細胞の純化・回収法が世界に先駆けて初めて確立された。これらの成果に関する論文は、現在投稿中である。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)