【研究領域課題番号】20K08325 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膵臓 / ドパミン / ヘテロ性 / β細胞 / インスリン / ROS / 脱分化 / 糖尿病 / 膵島 / ドーパミン

【研究成果の概要】

1型糖尿病や2型糖尿病の治療に対し膵島や膵臓移植が有効な治療法である。しかし、ドナー不足がこれらの治療法を広く利用することの妨げになっているため、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）からの膵β細胞分化誘導法が近年の研究により確立されつつある。
一方でヒトiPS細胞由来β様細胞への分化誘導細胞が試験管内で成熟度を長期間保持することは困難であり、誘導されたインスリンを分泌できる細胞群を用いて糖尿病モデルマウスへの移植実験を行うと移植後に移植された細胞の細胞死や脱分化によりインスリン分泌を維持でない現状がある。
我々が着目するドパミンを介するβ細胞間のシグナル伝達は移植後の細胞機能が維持できない問題点を改善する一因であると考えている。膵島内でのドパミン合成に関与する酵素であるTyrosine Hydroxylase（TH）陽性細胞は全膵島細胞中の5%以下しか存在しない。これまでの研究の中で膵臓β細胞内外のドパミン濃度はインスリン分泌の抑制や細胞の成熟度、細胞死の誘導を制御するうえで重要な因子である。TH陽性細胞と陰性細胞間のドパミンの受け渡しによる細胞集団としての膵島の細胞間相互作用を理解することはiPS細胞を用いた臓器再生に向け重要であると考えている。今年度は、前年度までに得たTH陽性細胞に隣接するTH陰性のβ細胞の機能低下について分子生物学的手法を用いて研究を進めるとともに一部にTH陽性細胞を含む膵島細胞集団としての機能評価も併せて行った。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究領域課題番号】19K17977 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン分泌 / 膵β細胞 / ユビキチン / 糖尿病 / インスリン

【研究成果の概要】

ゲノムワイド関連解析で東アジア人特有の2型糖尿病関連遺伝子としてUBE2E2が報告されたが、その機序は不明である。膵β細胞における役割を検証するため、膵β細胞特異的UBE2E2トランスジェニックマウス(TGマウス)を作製した。独立した2ラインで糖負荷試験時のインスリン分泌低下を伴う高血糖を呈した。離乳期以前のβ細胞量と増殖能の低下、p21の発現高値を認めた。プロテオーム解析でMesothelin(MSLN)の著明な低下を認めたが、MSLN全身ノックアウトマウスは正常耐糖能であった。
膵β細胞のUBE2E2の過剰発現は個体としての膵β細胞量の低下を介して糖負荷後のインスリン分泌低下に関与していた。

【研究の社会的意義】

本研究に用いるモデルマウスは当研究室で独自に作製されたものであり、類似の研究結果は国内外を含め未だ報告されていない。また、以前より日本人と欧米人の糖尿病の病態は異なることが広く知られているが、本研究結果で明らかになった事象に基づき検討を行うことで、日本人に特徴的な糖尿病発症の素地やメカニズムの一端を解明できるかもしれない。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究領域課題番号】19K08671 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

SGLT2 / ミネラルコルチコイド / 近位尿細管 / ナトリウム輸送 / 高血圧 / 糖尿病 / 慢性腎臓病 / アルドステロン / アルドステロン受容体 / SGLT2阻害薬 / インスリン / 腎障害 / 鉱質コルチコイド

【研究成果の概要】

本研究では近年脚光を浴びるSGLT2阻害薬とミネラルコルチコイド受容体拮抗薬が近位尿細管のNa輸送体NHE3およびNBCe1の輸送活性の調節にどのように関与するかを解析した。アルドステロン腎障害モデルラットにおいて近位尿細管のNa輸送活性が亢進すること、および通常ラットにおいてSGLT2阻害薬がアルドステロンによるNa輸送活性亢進を抑制することが確認された。また、近位尿細管での体液貯留機序において重要なPPARγの内因性シグナルについて解析し、酸化LDL代謝産物azPCが関与することを認めた。

【研究の社会的意義】

本研究は、日本および世界、特に先進国や一部発展途上国において健康上の重要な脅威となる高血圧および慢性腎臓病の発症・進展機序の解明につながることが期待される。また、現在脚光を浴びる一部の治療薬の作用機序の解明につながる発見がなされたことにより、今後の治療薬の開発、疾患治療において重要なポイントを明らかにしたことは、今後の高血圧、慢性腎臓病の発症・進展の予防、さらにはこれらの疾患のend stageとしての心血管イベントや腎廃絶といった生命予後に関わる病態の予防にもつながるものである。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究領域課題番号】18K08504 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

高中性脂肪血症 / リポ蛋白リパーゼ / ホルモン感受性リパーゼ / アポリポ蛋白A5 / SREBP1c / インスリン / リパーゼ / 糖尿病 / 致死的代謝異常 / レプチン

【研究成果の概要】

細胞内の中性脂肪やコレステロールエステルを水解するリパーゼであるホルモン感受性リパーゼ(HSL)の欠損マウスを主に用い、その他にもリポ蛋白リパーゼ(LPL)の補因子であるアポリポ蛋白A5(apoA5)の欠損マウス、脂質代謝における重要因子であるSREBP-1cの欠損マウスなどを用い、リパーゼと糖尿病との関連について研究を行った。
HSL欠損はインスリン欠乏下での生存に有利なことを見出し、apoA5欠損でのカイロミクロン蓄積はSREBP-1c非依存的である一方、VLDL蓄積はSREBP-1c依存的であることを見出した。

【研究の社会的意義】

2014年にホルモン感受性リパーゼ(HSL)のヒトでの欠損家系が初めて報告され、HSL欠損は糖尿病と強く関連していることが示された。しかしこれまでにHSL欠損マウスでの研究で得られた知見からは糖尿病と強い関連は示されていなかった。ある種の高炭水化物食がHSL欠損マウスで脂肪肝やインスリン抵抗性を誘発するという予備的知見を元に、HSL欠損と糖尿病との詳細な関連を探った。この研究により糖尿病や糖尿病性高中性脂肪血症に対する新たな治療targetが示される可能性が期待されている。また、apoA5欠損マウスを用いた研究からは高中性脂肪血症のメカニズムの一端が解明され、今後の応用が期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究領域課題番号】18H02861 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膵臓β細胞 / ドパミン / VMAT2 / インスリン分泌 / 膵臓 / 内分泌細胞 / 血糖維持 / 分化 / 多能性幹細胞 / インスリン / 糖代謝 / 増殖 / 膵臓分化 / 内胚葉 / 糖尿病 / 分化誘導 / 恒常性維持 / 分泌

【研究成果の概要】

膵臓β細胞の恒常性維持の分子基盤の解明を目指し、膵臓β細胞特異的なVMAT2遺伝子変異マウスの解析を進めた。変異マウスでは、細胞内ドパミンが減少し、糖応答性インスリン分泌が上昇した。高脂肪食を給餌した条件では、β細胞の脱分化、β細胞死や耐糖能の悪化が認められた。詳細な解析の結果、糖応答性インスリン分泌とともにドパミンが分泌されるが、VMAT2の欠失β細胞では、再取り込みされたドパミンは分泌小胞に格納されずに、細胞内の分解酵素MAOにより分解され、ROSが発生する。高脂肪食条件では、インスリン分泌が亢進し、次第にβ細胞はROSにより脱分化、そしてβ細胞死が引き起こされることに至ることが分かった。

【研究の社会的意義】

VMAT2-ドパミンシグナルは膵臓β細胞の分化抑制シグナルとして働くのみならず、β細胞の量を制御するシグナルでもあり、糖応答性インスリン分泌を負に制御するシグナルである。一方、VMAT2-ドパミンシグナルを欠くと、糖応答性インスリン分泌が亢進した。高脂肪食給餌条件下では、β細胞特異的VMAT2遺伝子変異マウスは、対照の野生型よりも早く耐糖能の改悪を示し、β細胞の脱分化、脱落を引き起こした。これらの結果から、膵臓β細胞を正常に維持するためには、負に制御するシグナルが重要な役割を果たすことが示された。膵臓β細胞の恒常性維持のためには、その機能を適宜に制御することが重要であることが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】17K09455 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膵臓 / インスリン / ドーパミン / GPCR / iPS細胞 / 分化 / 膵β細胞 / iPS / 脱分化 / 糖尿病 / 再生医療

【研究成果の概要】

ヒトiPS細胞から分化誘導したβ様細胞への分化効率の上昇と成熟度の向上にドーパミンの合成阻害剤やドーパミンを貯留するためのトランスポーター（VMAT2）の阻害剤の培地中への添加が効果的である。脱分化の進行を抑制することが主たる効果であった。
β様細胞の分化、成熟化の過程でみられる弱いインスリン分泌は細胞の成熟化を促進する遺伝子の発現上昇とともに、同時進行する脱分化を促進することを明らかにした。また、VMAT2を膵β細胞でのみ欠失するマウスの解析実験により生体内では生後も成熟化・脱分化をβ細胞毎に違うバランスにおくことで一部のβ細胞だけが膵臓内で機能することが示唆された。

【研究の社会的意義】

β細胞が主たる構成要素である膵島は内部のβ細胞が均一な分化・成熟化レベルではない。高い成熟度を維持し続けることは、β細胞の脱分化・細胞死につながることを本研究におけるマウス個体を用いた実験で実証した。今後、再生医療にヒトiPS細胞由来β様細胞を使用するうえで、より長期的かつ生体内に近い血糖値維持を達成するためには、生体内における膵島内の細胞間相互作用を理解、再現することが必要不可欠である。モノアミンを介した細胞間相互作用機構の一部を解明することができたことは、再生医療の実現化に貢献できたと考える。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】17K08625 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン / IGF / シグナル伝達 / インスリン受容体基質 / ユビキチン / 糖尿病 / がん / インスリン様成長因子 / Nedd4 / USP / USP15

【研究成果の概要】

インスリン/インスリン様成長因子（IGF）は動物の代謝調節や成長に重要である。これらが標的細胞に作用して起こす細胞内シグナルに異常が生じると、糖尿病やがんの発症につながる。本研究では、シグナルを仲介するインスリン受容体基質（IRS）のモノユビキチン化レベルが複数のユビキチンリガーゼと脱ユビキチン化酵素によって制御され、新しいメカニズムでシグナル強度を調節していることを発見した。さらに、これらの酵素がIRSを基質として認識する分子機構や、酵素活性の調節機構の一端も明らかにした。

【研究の社会的意義】

我々は以前、インスリン/IGFの細胞内シグナルがIRSのモノユビキチン化によって制御されることを独自に発見していた。本研究では、この過程に関与するユビキチンリガーゼと脱ユビキチン化酵素を同定し、その作用機序を調べることで、研究を進展させた。本研究は、インスリン/IGFシグナルの新たな制御メカニズムの発見として、学術的価値が高い。また、同定した酵素を標的とすることで、インスリン/IGFシグナルを修飾する方法を開発できる可能性を示すことができた。この開発が成功すれば、糖尿病やがんの新しい治療法の開発につながると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】15K19506 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脂質 / 糖尿病 / インスリン / ホルモン感受性リパーゼ / リポ蛋白リパーゼ / MCTオイル / 脂質異常症 / カイロミクロン

【研究成果の概要】

高中性脂肪(TG)血症の成因には完全に解明されていない点が多い。研究代表者らはインスリン欠乏性高TG血症に着目し、ホルモン感受性リパーゼ欠損マウスではTG上昇が軽微に留まることを見出し、その分子機構の解明を目指した。また、その他の各種脂質関連遺伝子欠損マウス、MCTオイル、triton WR-1339を用いた実験系からも、高TG血症の成因解析を進めた。その結果、リポ蛋白リパーゼ(LPL)による脂質異化とは異なる、新規メカニズムによる高TG血症の存在が示唆され、現在解析を進めている。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】26670451 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

代謝 / 糖尿病 / ＴＦＧ / インスリン / 糖・脂質代謝 / TFG

【研究成果の概要】

我々は、PTENに結合するタンパクを網羅的に同定する過程でTFGを同定した。培養細胞ではTFGを過剰発現することで、細胞内PIP3の量が増加した。しかし、一方、TFGは近位筋優位遺伝性運動感覚ニューロパチーの原因遺伝子であり、この疾患では高率に糖尿病を合併する。そこで、我々は、TFGの神経および代謝における役割を明らかにするために、臓器特異的なTFG KOマウスの作成を行った。全身的なTFG KOマウスは胎生致死であったが、膵β細胞特異的KOマウスはβ細胞量の減少と、グルコース反応性のインスリン分泌低下を示した。従って、TFGはインスリン分泌に重要な働きをしていることが判明した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2016-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】26293219 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

代謝 / 糖尿病 / Pin1 / インスリン / プロリン異性化酵素 / メタボリックシンドローム / 肥満 / シグナル伝達 / 肝細胞 / LUBAC / TFG / メタボシックシンドローム / インスリン抵抗性 / インスリン分泌

【研究成果の概要】

プロリン異性化酵素とは、プロリンとそのN端側のアミノ酸と間のペプチド結合をcis体からtrans体に変化させることで標的タンパクの機能変化を誘導するユニークな酵素である。今回、Pin1はAMPKのγサブユニットに結合し、AMPK活性化抑制から脂肪分解を抑制することが判明した。さらに、Pin1は、転写共役因子PRDM16に結合し分解を促進することで脂肪細胞におけるUCP1発現を抑制することを見出した。以上から、過栄養状態で増加したPin1は多様な標的タンパクと相互作用し、全身レベルでの代謝異常や慢性炎症の発症に寄与する。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】16,900千円 (直接経費: 13,000千円、間接経費: 3,900千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】26253059 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

多能性幹細胞 / 分化誘導 / 糖尿病 / 再生医療 / 膵臓 / 代謝 / 増殖 / モノアミン / ドパミン / インスリン / 化合物 / 再生医学 / 膵β細胞 / 膵臓β細胞

【研究成果の概要】

本研究ではヒトiPS細胞から十分な機能を持つ膵臓β細胞を作成するために、分化誘導の促進化合物の同定、作用機序の解明を目指した。また、代謝による分化促進の利用により成熟度の高い膵臓β細胞の作成を目指した。その結果、新規にWnt シグナルがβ細胞の分化に対して促進効果があること、マウスES細胞の系で見られたVMAT2-モノアミンによる分化抑制効果はヒトiPS細胞の分化誘導系にも存在することを見出した。また、成体膵島におけるドパミンD2受容体を介した膵臓内分泌β細胞の量を負に制御する機序が存在し、この機序は、Gタンパク共役受容体であるアデノシン受容体A2Aの抑制にもカップルしていることが分かった。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】41,340千円 (直接経費: 31,800千円、間接経費: 9,540千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】26460369 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン / インスリン様成長因子 / インスリン受容体基質 / ユビキチン / がん / 糖尿病

【研究成果の概要】

代謝調節ホルモンであるインスリンへの体の応答性が低下すると糖尿病が起こる。一方、インスリンと構造の似たインスリン様成長因子（IGF）には成長促進作用があり、IGFへの応答性が過度に高まるとがんを発症しやすくなる。これらの応答性が変わるしくみには不明点が多い。今回、インスリン/IGFが細胞膜受容体に結合した後で起こる細胞内シグナル伝達を調べた。その結果、シグナル伝達を担うIRS2が別のタンパク質Nedd4と複合体を形成しており、この複合体が不足するとインスリン応答性が低下し糖尿病につながる、一方、この複合体が過剰に存在するとIGF応答性が過度に高まりがん細胞の過増殖の一因になることがわかった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2014-04-01 - 2018-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】動物生産科学

【研究領域課題番号】25221204 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

代謝・内分泌制御 / インスリン / インスリン様成長因子 / インスリン受容体基質 / 細胞内シグナル伝達 / 糖尿病 / がん / インスリン様活性 / 細胞内シグナル / 増殖 / 翻訳 / スプライシング / 糖取り込み / インスリン抵抗性 / 成長異常

【研究成果の概要】

動物の正常な生命活動に必須な同化ホルモン、インスリン／インスリン様成長因子（IGF）の広範な生理活性（インスリン様活性）の発現には、シグナル伝達分子であるインスリン受容体基質（IRS）が必須である。我々は、IRSが多くのタンパク質（IRSAP）やRNAと相互作用して巨大な分子複合体（IRSome）を形成し、これが全く新しいメカニズムでインスリン様活性の調節に重要な役割を果たすことを解明した。更に、IRSAPの量やIRSとの相互作用を制御することにより、がんや糖尿病をはじめとした種々の疾病の症状を緩和できることを証明した。

【研究の社会的意義】

IRSは、インスリン／IGFの作用発現を仲介するシグナル分子と考えられてきたが、本研究により、ホルモンの刺激とは独立して、他のタンパク質やRNAなどと相互作用し、インスリン様活性を修飾する「足場タンパク質」としても機能していることを示した。研究過程で、IRSomeにはRNAが含まれ、これが複合体の形成と同時に、RNA代謝を調節している、また、アミノ酸欠乏のシグナル自身がインスリン様活性を誘導するという全く新しい代謝調節機構の存在も明らかにし、これらの学術的意義は高い。本研究の成果は、成長異常、糖尿病、老化、がんなどに対して、全く新しい機序で作用する薬剤や治療法の開発への利用が期待できる。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2013-05-31 - 2018-03-31

【配分額】215,800千円 (直接経費: 166,000千円、間接経費: 49,800千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】24380152 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン / 糖尿病 / 糖輸送担体 / ジアシルグリセロールキナーゼ / インスリン抵抗性 / 低分子化合物 / ジアルシグリセロールキナーゼ / インスリン受容体基質 / ジアシルグリセロールキナーゼζ / 高糖尿病薬 / PIP5K / 糖輸送担体（GLUT4) / 細胞膜移行 / 2型糖尿病 / 糖取り込み

【研究成果の概要】

我々は、DGKζがIRS-1と結合することによって、既知のインスリンシグナル活性化とは独立にGLUT4の細胞膜移行を制御していることを明らかにした。さらに、DGKζ結合タンパク質であるPIP5K1αはDGKζと結合することによってGLUT4の細胞膜移行を促進していることが明らかとなった。
IRS-1とDGKζの結合を検出するELISAキットを用いて、IRS-1とDGKζの結合を阻害する低分子化合物を３０種類以上単離した。そのうちの一つの化合物Aは、細胞に添加することによって、IRS-1とDGKζの結合を阻害し、TNF-αによって誘導されたインスリン抵抗性を解除することを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2016-03-31

【配分額】18,070千円 (直接経費: 13,900千円、間接経費: 4,170千円)

【研究分野】内分泌学

【研究領域課題番号】24790949 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ES・iPS細胞 / 膵β細胞 / インスリン / 糖尿病 / 低分子化合物 / モノアミン / 膵臓 / β細胞 / VMAT2 / ｃAMP / ES・iPS / 膵 / ES / iPS

【研究成果の概要】

本研究では、1200の低分子化合物の中からVMAT2阻害剤にマウスES細胞から膵β細胞を分化誘導する効果が高める効果があることを見つけました。VMAT2は細胞内小胞に存在するモノアミン量を調節する因子です。そして、膵β細胞が糖濃度に応じてインスリンを分泌する能力を促進する化合物も見つけました。これらの2種類の化合物を併用して分化湯堂を行い、糖尿病モデルマウスへ移植したところ正常な血糖値に回復しました。今後、この研究で得られた情報をもとにヒトiPS細胞からの膵β細胞の分化誘導を進め、将来的な臨床応用に貢献できるよう研究を進めます。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】24790928 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン / インスリン様成長因子 / インスリン受容体基質 / 糖尿病 / ユビキチン / 細胞内シグナル / Nedd4 / Epsin1 / 細胞内シグナル伝達 / 国際情報交換　スウェーデン

【研究成果の概要】

インスリンとインスリン様成長因子(IGF)は互いに類似した構造のホルモンで、インスリンは血糖値の調節に、IGFは細胞増殖や個体成長に重要な役割を果たします。私達は、これまでにインスリンやIGFの細胞内情報伝達を担うタンパク質の一つ「インスリン受容体基質」がモノユビキチン化という種類の分子修飾を受けるとインスリンやIGFの作用が強まることを見つけており、今回の研究によってその詳細な分子機構を明らかにすることが出来ました。また、肝臓では細胞が受け取る栄養量が変化すると、この新しい機構を介してインスリンへの応答性が変化することも明らかになり、糖尿病発症機構の理解にとっても重要な発見と考えられました。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】24659443 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

糖尿病 / 脂質 / インスリン分泌 / 脂肪細胞 / リパーゼ / メタボローム解析 / インスリン / 脂肪分解 / インスリン分泌刺激物質

【研究成果の概要】

カテコラミン刺激によるインスリン分泌という生理現象があるがその分子機構は未解明である。申請者らは、脂肪細胞における脂肪水解を担うリパーゼであるホルモン感受性リパーゼ(HSL)の欠損マウス（HSLKO）において検討を行った結果、この現象がHSLKOでは全く認められないことを見出した。この現象はインスリン分泌に影響する既知のホルモンの変動では説明できず、 カテコラミン刺激による脂肪細胞のHSL依存性脂質水解により産生される代謝産物がインスリン分泌を促進している可能性が示唆された。メタボロミクス解析により複数の候補物質を同定し、現在in vivo、in vitroでの検証を進めている。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】22790653 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ES細胞 / 膵臓 / β細胞 / インスリン / 糖尿病 / 低分子化合物 / スクリーニング / 発生・分化 / 再生医学 / 細胞・組織

【研究成果の概要】

マウスES細胞から膵β細胞を誘導する手法の効率化は将来的にヒトの糖尿病治療に有効な知見を得るために重要な研究である。我々は、1300種の低分子化合物からβ細胞の誘導効率を上昇させる化合物をスクリーニングした。その結果、10個のヒット化合物を発見し、これらの作用から特定の生体内の経路がβ細胞への細胞分化とインスリンの分泌能に深くかかわることを見出した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】19580324 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン / 糖尿病 / インスリン受容体基質(IRS) / DGKζ / 脂質 / IRS

【研究成果の概要】

本研究ではIRSと結合するDGKζ活性がGlut4 の細胞膜移行を阻害するメカニズムを解明し、インスリン抵抗性の発生とIRS-1 結合性DGKζとの関連を明らかにすることを目的としている。3T3-L1 adipocytes において、siRNA によってDKGζをノックダウンすると、インスリン非依存的な糖取り込み量に変化は認められないが、インスリン依存的な糖取り込み量が有意に減少すること、さらにインスリン依存的なインスリンシグナル分子の活性化には全く影響しないことを明らかにした。続いて、阻害剤を用いて、DGK の活性を阻害したところ、インスリン依存的な糖取り込みが促進されることが明らかとなった。しかし、インスリン依存的なインスリンシグナル分子の活性化には全く影響を与えなかった。一方で、糖取り込み担体であるGLUT4 の細胞膜移行はインスリン非依存的に促進されており、DGK 活性はGLUT4 の細胞膜移行を阻害していることが明らかとなった。これらの結果から、DGKζは、複雑な機構によってこれまでに知られているインスリンシグナルとは異なる新規シグナルを介して、インスリン依存的な糖取り込みを制御していることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】18370084 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

オートファジー / インスリン / 糖尿病 / アミノ酸 / mTOR / FIP200 / ULK / ULK1

【研究成果の概要】

本課題ではオートファジーによる細胞内分解がどのように制御されるかについて、特に内分泌系に注目して解析を行うことを目的とした。まずオートファジーの生理的な制御機構を解析する目的で、栄養のマスターレギュレーターとして知られるタンパク質キナーゼmTORについて研究を行った。栄養飢餓時のmTORの不活性化を各臓器で調べたところ、各臓器のmTOR不活性化のタイミングはオートファジーの開始と非常に良く相関しており、実際生体内でもmTORがオートファジー制御に中心的役割を担っている可能性が示唆された。次にmTORの上流因子としてのインスリンの関与を、糖尿病モデルマウスを用いて調べた。その結果、ストレプトゾシン誘導性I型糖尿病モデルでは摂食時においてもオートファジーが誘導されることが観察され、それは心筋、骨格筋、肝で特に著明であった。また、この効果はインスリンと糖の投与について一部抑制可能であった。しかし、これらのマウスにおいても、絶食によってさらにオートファジーが誘導されるため、インスリンが主要なオートファジー制御因子ではあるものの、それ以外の因子の関与も示唆された。反対に、mTORの下流で機能するオートファジー制御因子として新規にFIP200というULK1結合因子を同定した。この因子はアミノ酸飢餓によって誘導されるオートファジー、および増殖因子の飢餓によって誘導されるオートファジーのいずれにも必要であることが判明した。この因子とmTORとの関連をさらに解析することによって、オートファジーの制御機構がより明らかにされることが期待される。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】17,620千円 (直接経費: 15,400千円、間接経費: 2,220千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】18390271 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン / 糖代謝 / 糖尿病 / グルコーストランスポーター / プロテオミクス / Pin1 / 代謝 / シグナル伝達 / 糖取り込み

【研究成果の概要】

インスリンの作用には、IRS-1/2を介したPI3-kinase/Akt活性化が極めて重要な役割を果たしている。我々は、IRS-1に結合するタンパクを、免疫沈降からの複合体解析をLC/MS/MSのシステムを用いて網羅的に検索し、proryl isomerarse I(Pin1)を同定した。Pin1は、プロリンをtrans構造に変化させることでタンパクの構造変化をもたらし、機能を修飾する蛋白である。
重要なことに、Pin1は高脂肪食負荷に伴って発現量が増加する。また、絶食で低下し、食事の再摂取によって発現が増加する。Pin1は、IRS-1に結合しインスリンによるシグナル伝達を顕著に亢進させることが判明した。Pin1のKOマウスでは、肝臓や筋肉におけるインスリン抵抗性が認められた。また、Pin1をob/obマウスの肝臓に過剰発現させると、低下していたインスリン依存性のPI3-kinase/Akt活性化が回復し、耐糖能を顕著に改善した。これらを総合的に判断すると、Pin1の発現を増加させたり、Pin1と結合する部位であるIRS-1のSer434周囲に結合する分子を探索することで、インスリン感受性を改善する新規糖尿病治療薬開発への可能性が考えられる。また、GLUT4及びGLUT1のC末端に、flag tagとmyc tagを逆に配置したMEFタグを取り付けた蛋白(GLUT4/1-flag-TEV-myc)をコードするcDNAを作成し、これらを発現させた細胞から、高純度のGLUT4/1含有小胞を精製する。得られたGLUT4/1含有小胞より蛋白を抽出し、2次元電気泳動を行い、GLUT4/1含有小胞それぞれについてプロテオームマップを作成した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】17,400千円 (直接経費: 15,600千円、間接経費: 1,800千円)

【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】17780209 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン / ジアシルグリセロール / インスリン抵抗 / インスリン受容体基質(IRS) / 脂肪細胞 / 糖尿病 / ジアシルグリセロールキナーゼ / Glucose transporter(Glut4) / 細胞内シグナル伝達

【研究成果の概要】

インスリンは標的細胞の細胞膜上に存在する受容体に結合し、内蔵されたチロシンキナーゼを活性化する。活性化された受容体はインスリン受容体基質(IRS)をチロシンリン酸化、リン酸化されたIRSを認識して様々なシグナル分子が活性化され、インスリンの広範な生理活性、特に糖取り込みの促進が発現すると考えられている。これまで我々は、インスリン受容体基質(IRS)が他のタンパク質と大きな複合体を形成し、インスリンシグナルの強さを調節していることを明らかにしてきた。そこでIRS-1と結合するタンパク質をYeast Two-hybrid screeningで単離し、ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)ζの同定に成功した。このタンパク質、DGKζのインスリンシグナルにおける機能・役割を解明することが本研究の目的である。
今回我々は、まずsiRNAを用いた手法で3T3-L1脂肪細胞においてDGKζをノックダウンし、インスリン依存的な糖取り込みを測定した。その結果、インスリン刺激によって誘導される細胞内への糖の取り込みがDGKζのノックダウンによって有意に抑制され、DGKζはインスリン誘導性糖取り込みに必要であることが示された。続いて、DGKζの活性阻害剤で処理し、同様にインスリン依存的な糖取り込みを測定したところ、糖取り込み量が増強することが明らかとなった。またDGKζの活性を優位に阻害する変異体KN-DGKζを発現するアデノウイルスベクターを作製し、3T3-L1脂肪細胞に感染後、インスリン刺激し、糖取り込み量を測定した。その結果、阻害剤で得られた結果と同様に、糖取り込み量が増加していた。これまでTNF-α長時間刺激によって3T3-L1脂肪細胞においてインスリン依存的な糖取り込み量が抑制されることが知られており、インスリン抵抗性のモデルとして利用されている。驚いたことにTNF-α刺激によって誘導されるインスリン抵抗性はKN-DGKζの発現によって回復することが示された。以上の結果より、DGKζはIRSと結合することによってインスリン依存的糖取り込みに必要な機能を有している。さらにDGKζのキナーゼ活性はインスリン依存的な糖取り込みには抑制的に働いていることが明らかとなった。今回の結果から、DGKζの活性阻害剤は有力なインスリン抵抗性解除薬の候補となることが強く示唆された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】代謝学

【研究領域課題番号】17390260 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

糖尿病 / 遺伝子 / シグナル伝達 / PPAR / アディポネクチン / インスリン / 肥満 / 脂肪細胞

【研究成果の概要】

レジスチンの生理学的・病態生理学的意義を明らかにするために、肥満のインスリン抵抗性惹起におけるレジスチンの意義やインスリン分泌や中枢に対する作用を検討した。インスリン感受性アディポカインの代表であるアディポネクチンの欠損マウスにおけるPPARγアゴニストの抗糖尿病作用を検討した。ob/obマウスにPPARγアゴニストであるピオグリタゾンを10mg/kgの用量で投与したところ、有意に耐糖能障害を改善させたのに対し、アディポネクチン欠損ob/obマウスでは耐糖能障害の改善は認められなかった。一方、ピオグリタゾンを30mg/kg投与した場合、ob/obマウスにおいてもアディポネクチン欠損ob/obマウスにおいても耐糖能障害が改善された。このことから、PPARγアゴニストによる抗糖尿病作用にはアディポネクチン依存性の経路に加え、アディポネクチンを介さない作用も存在することが証明された。興味深いことに、レジスチンは、10mg/kgの投与で変化せず、30mg/kgの投与によってはじめて低下した。また、高脂肪食誘導時にはβ細胞のインスリン分泌能が低下するが、β細胞量が代償的に増加することによりインスリン抵抗性に適応するが、この適応が障害されているグルコキナーゼヘテロ欠損マウスにおいてもレジスチンの役割を検討している。レジスチンの細胞内情報伝達に関しては、アディポネクチンの細胞内情報伝達を障害させていることを見出し、その上流あるいは下流に関して新たなシグナル分子を探索している。また、レジスチンが抑制するアディポネクチンの中でも高分子量のアディポネクチンが高活性型であることを明らかにした。興味深いことに、血中においては高分子量、中分子量、アルブミンに結合した低分子量の形態でアディポネクチンが存在していることを明らかにした。さらに、脳脊髄液中においては、このアルブミンに結合した低分子量の形態でアディポネクチンの多くが存在していることも明らかにした(投稿後、論文推敲中)。レジスチンが脳脊髄液中でどのような立体構造をとっているのか、アディポネクチンの作用を中枢でも抑制しているのか、検討している。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】15,400千円 (直接経費: 15,400千円)

【研究分野】内分泌学

【研究領域課題番号】16590904 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

糖尿病 / 膵臓 / Notch / RBP-J / β細胞 / インスリン / Notch1 / Notch2

【研究成果の概要】

1型糖尿病の細胞移植治療のために、β細胞の発生分化機構の解明が必要である。Notch系の分子のRBP-Jの全身性遺伝子欠損マウスは胎生10日目の、膵の発生の初期に致死となり、膵の異常が指摘されている。胎生致死で詳細な解析が困難であるために、Notch系の関与の詳細は不明である。本研究では、膵におけるNotch-RBP-J系の意義を検討した。
Notch2遺伝子発現は膵管細胞に高濃度に認められた。β細胞の前駆細胞の膵幹細胞は膵管に存在することが示唆されており、Notch2が膵幹細胞の未分化性の維持に関与している可能性を示唆した。しかし、Pdx1プロモーター特異的Notch2遺伝子欠損マウスを作製、解析したが、膵で形態学的に、異常は認められなかった。
Pdx1promoter RBP-J遺伝子欠損マウスでは、胎生11.5には、グルカゴン陽性細胞、PP陽性細胞が対照より多く出現することを認めた。胎生15には、膵管細胞をより多く認めた。生まれたマウスの膵は小さくβ細胞は著明に減少しいて、インスリン分泌低下型糖尿病を呈した。rat insulin II promoter(RIP)Creマウスと交配で得られたRBP-J遺伝子欠損マウスでは、膵でほぼ完全にRBP-J遺伝子が欠損していることをサザンブロット解析で確認したが、異常は全く認められなかった。
以上の結果より、膵の発生過程で、Notch2は必須ではないことを示され、膵の発生過程では、Notch2ではなくNotch1が必須であるか、両者が互いに代償し合っている可能性が示唆された。Pdx1promoter RBP-J遺伝子欠損マウスの結果より、膵でNotch/Rbp-jシグナルは内分泌細胞・膵管細胞の早期分化を抑制し膵前駆細胞プールを維持する役割があることが示唆された。また、インスリンを発現する成熟β細胞では、Notch/Rbp-jシグナルが特に生理的な役割を果たしていないことが示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】医用生体工学・生体材料学

【研究領域課題番号】14780647 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

糖尿病 / 細胞シミュレーション / システム生物学 / インスリン / 尿素回路 / E-Cell / E-CELL / 肝臓 / バイオインフォマティクス / 膵β細胞

【研究成果の概要】

本年度は、糖尿病の病態形成において主要な役割を果たす肝臓のモデル化を行った。その際、肝細胞(単一細胞)のモデルを敷衍して、肝小葉、肝臓といった高次の構造をモデル化することを試みた。近年の生物学の知見の多くは分子・細胞レベルのものなので、これを利用しつつ、組織、器官レベルを理解する方法の開発が今後重要となる。肝臓は肝小葉の繰り返し構造であり、肝小葉は、門脈枝から中心静脈にかけての類洞(毛細血管)とそれに接する肝細胞索を基本単位としている。そこで、この基本単位を、単一肝細胞モデルを直列に並べ類洞モデルによって接続する単純なモデルで表現し、既存の知見と比較した。代謝経路としで知見が多くかつコンパクトな尿素回路をモデル対象とした。尿素回路に関連する酵素、代謝物質は肝小葉内で不均一に分布していることが知られているが、8コンパートメントの直列肝細胞モデルを主体とした我々のモデルは、既知の不均一性をよく再現した。このモデルには、既知の尿素回路関連酵素について知られている3種類の遺伝子発現勾配が含まれているが、この結果は、これらの遺伝子発現勾配で尿素回路の肝小葉内不均一性が説明可能であることを示唆している。
また、糖代謝全体を俯瞰するための単純な糖代謝モデルも構築した。インスリン分泌、インスリン動態、インスリンによる調節を含む糖代謝の各モデルを連結した10元程度の微分方程式モデルで、経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)の時系列のシミュレーションを試みた。その結果、健常者の検査結果を再現するパラメータセットを得ることができた。今後は、このモデルを用い(必要に応じて改善、拡張し)、種種の病型の糖尿病患者のOGTT結果の再現を試みていく予定である。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】14370219 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞老化 / 血管老化 / テロメア / Ras / アンジオテンシンII / インスリン / Akt / p53 / p21 / 動脈硬化 / 動脈瘤 / 糖尿病

【研究成果の概要】

我々はヒトから得られた動脈サンプルを検討し、非動脈硬化巣では老化細胞を認めないのに対し、動脈硬化病変においては老化した血管細胞を認めることをはじめて明らかにした。またこれらの老化細胞では血管細胞機能障害の形質を示していたことから細胞レベルでの老化が血管老化・動脈硬化の新たなメカニズムの一つであると考えられた。そのメカニズムを検討するため、我々は当初、テロメア、テロメレースに注目し研究を進めた。その結果、テロメア機能不全による血管細胞老化とそれに伴う細胞機能障害が動脈硬化の病態生理に深く関与しており、細胞老化抑制による血管老化治療の可能性を示唆した。さらに我々は、動脈硬化巣における細胞老化のメカニズムとしてテロメア短縮だけでなく過剰な増殖シグナルによるRas/ERKの活性化も関与し、それらによるサイトカインの誘導が炎症の亢進やプラークの不安定化に重要であることを観察している。アンジオテンシンIIはRas/ERKを活性化し、様々な血管疾患に関与していることが知られている。本研究において我々は、アンジオテンシンIIにより血管細胞の老化が促進され動脈硬化が進展すること、老化シグナル制御によりその効果が抑制されることなどを観察した。酵母・線虫ではインスリン・Aktシグナルの低下により寿命が延長するが、ヒトの老化に対する作用は明らかではなかった。これに対して我々は、インスリン・Aktシグナルがヒト血管内皮細胞の寿命をnegativeに調節していることを世界で初めて明らかにした。インスリン・Aktシグナルによって老化した血管内皮細胞は様々な機能障害の形質を示したこと、糖尿病患者の動脈硬化巣や糖尿病マウスの血管において老化した血管細胞が多数存在し、それらの細胞でのAkt活性が上昇していたことから、糖尿病はインスリン・Aktシグナルの過剰な活性化によって生じる一種の早老症候群であると言える。以上のように、細胞レベルの老化の促進が血管の老化の病態生理に関与しており、老化シグナルの制御は、今後新たな血管治療のストラテジーとなりうると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】7,600千円 (直接経費: 7,600千円)

【研究分野】食品科学・製品科学

【研究領域課題番号】12460054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アミノ酸 / 転写因子 / IGF結合タンパク質-1 / DNAマイクロアレイ / インスリン受容体 / mTOR / ロイシン / 翻訳調節因子 / IGF結合タンパク質 / フォークヘッド / 翻訳制御因子 / エチオニン / インスリンレセプター / 翻訳開始因子 / インスリン / IGFBP-1 / 糖尿病 / USF / HNF-3

【研究成果の概要】

インスリン様成長因子結合タンパク質I(IGFBP-1)の遺伝子転写制御を指標として、アミノ酸が遺伝子の発現を制御する機構を解析したところ以下の新知見が得られた。ロイシンによる同遺伝子の発現制御は、ワートマニンとラパマイシンに感受性の経路を介すること、ロイシンは細胞内で認識されること、核内外の転写因子の移動も重要であること、等である。これに関与する転写因子として、HNF-3ファミリー、FoxOファミリーを同定し、それらの遺伝子発現がタンパク質・アミノ酸依存性に変化することを明らかにした。IGFBP-1遺伝子プロモーターにはUSFも結合し、USFの量の変化もアミノ酸による転写制御に関わっていることもわかった。III型コラーゲン遺伝子の発現もアミノ酸に良く応答するが、グルタミンの作用が顕著であり、その効果はATP合成を必要とするものであることを示した。食餌タンパク質のアミノ酸バランスに応答する遺伝子をDNAマイクロアレイにより網羅的に解析し、応答性遺伝子の全体像を明らかにした。インスリンの情報伝達機構は、タンパク質栄養の悪化により強められ、それは主にIRS-1のセリンリン酸化の減少とIRS-2遺伝子の発現によるものであることを初めて明らかにした。タンパク質の翻訳制御を標的とした一連の解析では、in vivoにおけるロイシンの作用には翻訳制御因子eIF4Eの活性制御がキーになっているが、骨格筋ではインスリンとは独立に、肝臓ではインスリン依存性に作用することがわかった。In vivoにおけるロイシンの作用もmTORのセリンリン酸化を介していることを証明した。さらにトリプトファンは肝臓特異的にeIF4Eに作用して翻訳を刺激すること、エチオニンはATP減少とmTOR活性低下を経て翻訳活性を抑制することなどもわかった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】13,900千円 (直接経費: 13,900千円)

【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】11480248 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肥満 / 糖尿病 / インスリン / 成長ホルモン / トランスジェニックラット / 細胞内情報伝達 / インスリン受容体気質 / チロシンリン酸化 / インスリン受容体基質 / 成長ホルモン受容体

【研究成果の概要】

肥満、あるいはインスリン非依存性糖尿病に随伴する第一義的な代謝異常はインスリン抵抗性である。このインスリン抵抗性の発現機構を明らかにすることはその治療法の開発にとっても極めて重要である。本研究では、我々が作出した2系統のヒト成長ホルモン(hGH)トランスジェニックラット(高hGH系統、低hGH系統)を用いて、インスリンとGHのクロストークという観点からインスリン抵抗性の発現機構を解明することを試みるとともに、株化細胞を用いてインスリンとGHの細胞内情報伝達系のクロストークの分子機構を明らかにすることを目的とした。GH遺伝子導入ラットを用いた本研究により、GH分泌の異常によりインスリン抵抗性が発現するが、インスリンの過剰分泌と肝臓の糖処理能力の向上が起こり、膵臓と肝臓がそれぞれの機能を維持できる限り血糖値や耐糖能を正常に保つことができることが明らかとなり、糖恒常性の維持における肝臓の重要性が改めて示された。また、GHの抗インスリン作用は、少なくとも2つの分子機構を介して引き起こされることがわかった。すなわち、GHの短時間刺激に応答して起こるPTPase活性化によってインスリンシグナルが抑制される機構と、インスリン依存性のGLUT4の細胞膜移行は阻害されないにも関わらずGHの長時間刺激に応答して起こる糖の取り込みが抑制される機構である。それぞれの機構を介して起こるインスリン抵抗性は、異なる生理的意義を持つものと推定される。今後、今回明らかになった分子機構を培養細胞系を用いて更に解明を進めるとともに、同様な現象がin vivo系でも観察されるかについて検討を進め、これらの分子機構の普遍性を証明していきたいと考えている。本研究の成果は、GHの生物学的な意義に対する理解を深めるとともに、その分泌異常に起因するヒトや動物の病態の解明にも貢献するものと考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】15,000千円 (直接経費: 15,000千円)

【研究分野】内科学一般

【研究領域課題番号】04557034 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

体細胞遺伝子治療 / 造血幹細胞 / サイトカイン / 糖尿病 / 骨髄移植 / CD34 / 多能性 / 自己複製能 / c-kit / 免疫寛容 / clonal deletion / clonal anergy / 骨髄キメラ / 遺伝子治療 / 血液幹細胞 / インシュリン / アガロース

【研究成果の概要】

体遺伝子治療の動物モデルシステムを確立し、つぎに理想的な標的細胞として考えられてきた造血幹細胞に焦点を絞り造血幹細胞の純化法の確立、in vitroでの増殖、マイクロインジェクション法やレトロウイルスを用いた遺伝子導入法の開発を目標に3年間研究をすすめた。その結果、まずヒトインシュリン遺伝子を導入した繊維芽細胞による糖尿病モデルマウスの治療に成功し、体細胞遺伝子治療のモデルシステムを確立することができた。このシステムではヒトインシュリン遺伝子とともに細胞表面抗原をコードするCD8の遺伝子を同時に発現させ、移植した繊維芽細胞の数をCD8に対する抗体で制御することによりインシュリンの産生量をある程度調節することも可能であることが示された。さらに移植した遺伝子導入繊維芽細胞の増殖をコントロールすることを目的としてアガロースカプセル内に細胞を包み込んでから移植する方法も開発した。次に、未分化な血液幹細胞はG0期にある細胞が多く、レトロウイルスによる効率の良い遺伝子導入が難しい。そこで純化した血液幹細胞を種々のサイトカインの存在下で培養し、その間にレトロウイルスを感染させることによって導入効率を挙げることができるかどうかを検討した。未分化な血液幹細胞に対する導入効率を調べる方法として、ネオマイシン耐性遺伝子を導入遺伝子として用い、レトロウイルスと共培養した細胞をネオマイシンを含んだメチルセルロース培地で培養してHPP-CFUアッセイを行った。種々のサイトカインの組み合せで実験を繰り返した結果、SCF、IL-1、IL-6、LIFの存在下で血液幹細胞をin vitroで短期間培養することによりレトロウイルス取り込みの確率を上げることが可能であることを示すことができた。また体細胞遺伝子治療の標的細胞の純化に関しても研究を進め、マウス骨髄中単核球の0.008%を占める、c-Kit陽性Sca-1陽性分化抗原陰性CD34陰性の細胞がほぼ造血幹細胞そのものであることを見つけ、わずか1個の造血幹細胞でも骨髄移植が可能であることを実験的に証明した。

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1992 - 1994

【配分額】15,800千円 (直接経費: 15,800千円)