【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】26253081 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経科学 / 老化 / 難聴 / 酸化ストレス / ミトコンドリア / アポトーシス / 平衡障害 / 加齢

【研究成果の概要】

体内の抗酸化物質Mn-SODが半減すると加齢により蝸牛の酸化ストレスが増悪し、音響外傷が増悪した。二酸化ゲルマニウ投与で蝸牛組織変性が生じ、ミトコンドリア機能が低下したが、タウリン等の投与により障害が抑えられた。ゲンタシンによる半規管の有毛細胞障害は支持細胞分裂により部分再生し、TrkB agonist投与により有毛細胞がより再生し機能も回復した。内耳不死化細胞は酸化ストレスでミトコンドリアの変性が生じ、膜電位が低下し、ミトコンドリアのfusion/fission機構や呼吸能が障害された。蝸牛有毛細胞にオートファジ―機構が存在し、機能しない場合には進行性の有毛細胞障害が生じた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】42,770千円 (直接経費: 32,900千円、間接経費: 9,870千円)

【研究分野】腎臓内科学

【研究領域課題番号】25461211 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

急性腎障害 / 心腎連関 / ミトコンドリア / 遠隔臓器障害 / 心筋障害 / アポトーシス

【研究成果の概要】

心腎連関症候群は、急性および慢性心不全が腎障害を惹起する、あるいは急性腎障害と慢性腎臓病により心疾患が発症・増悪する、という臨床的な観察に基づいて定義されているが、心臓と腎臓という二つの臓器をつなぐ病態メカニズムについては十分明らかにされていない。特に、急性腎障害が原因で心機能低下を呈するとされるType 3心腎連関症候群については基礎的な検討がほとんどなされていなかった。本研究では、腎虚血再灌流モデルを用い、急性腎障害が心臓組織におけるミトコンドリア断片化とアポトーシスを惹起すること、ミトコンドリア制御蛋白の一つであるDrp-1がこの現象において重要な役割を示していることを見出した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】20390440 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

老化 / 蝸牛 / ミトコンドリア / アポトーシス / 難聴 / 酸化ストレス

【研究成果の概要】

ビタミンC合成のできないSMP30/GNL欠失マウスを用いた研究ではビタミンCの内耳での著明低下により有意に老人性難聴が悪化すること、ビタミンCを過剰に補っても老人性難聴の予防はできないことが判明した。ミトコンドリア内のCatalaseを過剰発現させると老人性難聴の発現は抑止された。また17種の活性酸素除去効果のあるサプリメントの検討ではαリポ酸、CoQ10、NACの3種類に抑制効果が見られた。これら老人性難聴の進行が抑制されたマウスの蝸牛ではBakの発現が有意に減少していた。Bak欠失マウスでは老人性難聴は抑制された。これらの結果から、蝸牛内に生じる活性酸素による慢性的障害がBakを介したアポトーシスを蝸牛内細胞に引き起こし、老人性難聴が生じることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】19,500千円 (直接経費: 15,000千円、間接経費: 4,500千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】20591929 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子発現プロファイリング / アポトーシス / ミトコンドリア / 加齢変化 / 胚 / 卵子 / mtDNA copy数 / ATP / 胚発生能 / 受精能 / mtDNA / depletion / ゼブラフィッシュ

【研究成果の概要】

細胞質内に生命活動に必要な酸化的リン酸化代謝機能を司るミトコンドリアは卵子内に多く存在する。そのミトコンドリアDNA(mtDNA)はヒト未受精卵・未分割胚において30歳台より40歳台でcopy数の減少を認めた。また,分割胚において割球の体積とmtDNA copy数との間に正の相関関係を認めた。ゼブラフィッシュ胚を用いて,胚の形態と胚発生速度について検討を行った。形態不良胚は胚発生速度が遅く,老化したゼブラフィッシュ(12ヶ月齢,18ヶ月齢)からの胚発生効率は低下した。また,ゼブラフィッシュ胚のアポトーシスに関わるカスパーゼ遺伝子発現胚発生不良胚(遅延胚)におけるカスパーゼ遺伝子発現が亢進し,アポトーシスが亢進している事が認められた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】19592159 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ3 / 破骨細胞 / アポトーシス / 骨吸収 / 下顎前突症 / カスパーゼ / Caspase3 / 骨 / リモデリング / ミトコンドリア

【研究成果の概要】

アポトーシスとは、細胞の縮小や断片化、核の凝集と断片化といった形態的な特長を呈するあらかじめプログラムされた細胞死のことで、様々な分子間のシグナル伝達によるコントロールを受けている。そのなかでも、カスパーゼ3はシステインプロテアーゼの一種で、刺激により活性化されると、PARP(ADP-リボースポリメラーゼ)をはじめとするさまざまな細胞内基質を分解し、アポトーシスを誘導すると考えられている。骨形成を担う骨芽細胞は、骨細胞となり骨内に埋め込まれる際にその半数はアポトーシスすると考えられている。また、破骨細胞も骨吸収終了後に骨面から離れアポトーシスすることが示されている。骨系細胞のアポトーシスは骨組織における重要な代謝機構のひとつと考えられ、その調節を担うカスパーゼ3は何らかの関与をする可能性がある。そこで今回、カスパーゼ3遺伝子欠損マウスを用い、その役割を検索した。8週齢マウス頭蓋骨について肉眼観察及びX線撮影を行ったところ、遺伝子欠損型マウスの頭蓋冠はドーム状を呈し、眼耳平面と後頭蓋底前後径との交線は野生型に比べて鈍角となり、頭蓋の成長抑制が認められた。さらに、遺伝子欠損型では加齢に伴い頭蓋骨の膜性骨化の亢進と下顎前突症の所見が認められた。新生仔脛骨を通法に従い固定、脱灰後,パラフィン包埋による組織切片とし、TRAP染色を施したのち、顕微鏡にて破骨細胞の数を計測したところ、遺伝子欠損型では破骨細胞数の減少が認められた。この減少が骨芽細胞からの支持能減少に伴うものかどうかを検討するためにカルバリアより骨芽細胞を調整し、OPG mRNAの発現を検討した。遺伝子欠損型の骨芽細胞では野生型に比べ培養開始から、その発現量の増加が見られた。また遺伝子欠損型骨芽細胞のin vitroにおける石灰化亢進も認められた。アポトーシスを制御するカスパーゼ3の遺伝子欠損マウスでは、石灰化亢進を伴う頭蓋形成異常と、成熟破骨細胞数の減少を認めた。これらのことから、カスパーゼ3遺伝子は、骨芽細胞と破骨細胞のアポトーシス制御という面から、骨形成と骨吸収の微妙なバランスを保ち、正常な頭蓋の成長発育などを調整していることが示された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】18390239 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

心肥大 / 転写 / エネルギー代謝 / シグナル伝達 / P-TEFb / PGC-1α / HEXIM-1 / ミトコンドリア / 心不全 / アポトーシス

【研究成果の概要】

Cdk9活性化による遺伝子発現様式の変化の分子生物学的機構の解明
これまでPGC-1αの活性制御に関する研究は代謝需要に応じてmRNAレベルでその発現が誘導されるというこの転写共役因子に特異的な性質に注目が集まり、タンパク質としてのPGC-1αの機能制御、翻訳後修飾によるPGC-1αの機能制御、病態時におけるPGC-1αの機能異常、に関する研究は非常に遅れていた。我々は、(1)PGC-1αはユビキチン・プロテアソーム系によって分解を受ける半減期の短いタンパクであること、(2)核内で容易に凝集体を作りやすいという予想外の性格を持っていること、(3)この分解と凝集という一見相反する現象が分子内の異なったドメイン間の相互作用によって厳密に制御されていてそれによってPGC-1αの転写コアクチベーターとしての機能が維持されていることを見出し報告した。J Biol Chem.2007,282(35):25970-80。
心肥大の予後に及ぼすCdk9の過度の活性化の抑制の効果
Cdk9の内因性の阻害分子であるHEXIM-1を心筋に発現させたマウス(HEXIM-1-TG)を作成した。低酸素下(11%O_2)で飼育し肺高血による右室肥大を惹起するとHEXIM-1-TGは野生型のマウスと比較して右室肥大の形成が抑制されていた。HEXIM-1-TGの心臓では、サイロイドホルモン受容体の発現が選択的に低下し、その標的遺伝子であるα-MHC、SERCAの発現が低下していた。また、変異型HEXIM-1(Cdk9と結合出来ない)-TGとの比較解析から、HEXIM-1にはCdk9の阻害作用とは独立した作用があることを見出した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】17,750千円 (直接経費: 15,500千円、間接経費: 2,250千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】17590706 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

受動体チロシンキナーゼ / ドミナントネガティブ変異体 / トランスジェニックマウス / 心不全 / シグナル伝達系 / ミトコンドリア / アポトーシス / トランスクリプトーム / 受容体チロシンキナーゼ

【研究成果の概要】

Epidermal growth factor receptor (EGFR), ErbB2, ErbB3, ErbB4により構成されるErbBファミリーの受動態チロシンキナーゼは細胞増殖や分化、肥大など様々な細胞応答において重要な役割を果たしている。また、ErbBシグナルは多様で機能重複が存在する。
ErbBシグナルの心筋細胞における役割を生体レベルで解析するために、細胞内ドメインを欠失したEGFRドミナントネガティブ変異体をα-myosin heavy chainプロモーターによって心筋特異的に発現するトランスジェニックマウス(EGFR-DNマウス)を作成した。EGFR-DNマウスの心臓では、EGFやheparin-binding EGF-like growth factorによるEGFR, ErbB2, ErbB4のチロシンリン酸化、およびneuregulinによるErbB2, ErbB4のチロシンリン酸化が抑制されていた。その結果、ほとんどのTGは症候性の心不全をを呈し、5~20週齢で死亡した。TGでは心内腔の拡大と心室壁の菲薄化が見られ、心エコーでは心機能低下が認められた。また、EGFR-DNマウスの心臓ではTUNEL陽性の心筋細胞の有意な増加が見られるとともに、心不全発症前の2週齢の心臓から抽出したRNAサンプルを用いてGenechipを用いた遺伝子発現プロファイリングを行った結果、抗アポトーシス作用を有するBc12やBc1xLの発現低下が認められた。さらに、電子顕微鏡では、電子密度の減少した特徴的なミトコンドリア像が見られた。したがって、ErbBシグナルは心筋細胞においてミトコンドリアの構造機能の恒常性維持、さらにBc12やBc1xLの発現を転写レベルで維持することで、心筋保護的に作用している可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】16770090 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

GTP結合タンパク質 / ERA / RNA結合タンパク質 / アポトーシス / ミトコンドリア

【研究成果の概要】

昨年度の当該研究において、ERAはミトコンドリアに局在するGTP結合タンパク質であることが判明した。そこで、本年度はミトコンドリアにおけるERA複合体の同定および昨年度に引き続いてERA欠損マウスの作製を行った。
1、ERAを含むタンパク質複合体の精製およびその構成因子の同定
FlagおよびHisを付加したERAの安定発現HeLa細胞株を樹立し、その細胞からミトコンドリア粗抽出液を調整した。その後、抗Flag抗体を用いた免疫沈降、Niレジンを用いたアフィニティ精製を行うことで、高精製度のERAタンパク質複合体を得ることに成功した。さらに、その複合体をSDS-PAGEで分離し 複数の複合体構成分子由来のバンドを検出したのち、ゲルよりそれら構成分子を単離し MALDI-TOF-TOF/MSを用いた質量分析を行うことで、ERA複合体構成因子の同定に成功した。その結果、ERAはミトコンドリアでのタンパク質合成や細胞死制御に関与する因子と複合体を形成していることが判明した。
2、ERA欠損マウスの作製
昨年度、マウスERAゲノムのクローニングを行った。本年度は、Cre-loxP systemを用いたERA遺伝子のコンディショナルターゲッティングベクターを作製した。作製したターゲッティングベクターをマウスES細胞に導入し相同性組み換えを起こさせ、ERAヘテロ欠損ES細胞の樹立に成功した。現在、樹立したES細胞を用いてキメラマウスの作製を行っている。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】13680726 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

apoptosis / ERKs / phoslactomycin / PP2A / Bcl-2 / Erk / Bc1-2 / ミトコンドリア / リン酸化 / 細胞周期 / ERK2

【研究成果の概要】

Bcl-2のリン酸化の意義を解析するために、Bcl-2低発現細胞であるHepG2細胞に野生型Bcl-2および種々の変異型Bcl-2を発現させ、その機能解析を行った。様々な変異型Bcl-2を細胞に発現させた結果,通常ミトコンドリアに局在するBcl-2から膜貫通領域を欠損させ、局在を変化させた変異型Bcl-2(以後、Bcl-2ΔTMと略)においてBcl-2ΔTMタンパク質が恒常的にリン酸化されていることを見出した。細胞内におけるBcl-2ΔTMのリン酸化部位の同定を試みたところ,87番目のセリンが恒常的にリン酸化されていることが確かめられた。また、種々のリン酸化酵素阻害剤を用いてBcl-2ΔTMリン酸化酵素の同定を試みた結果,MEK1阻害剤のPD98059とU0126がBcl-2ΔTMのリン酸化を抑制することを見出した。さらに、in vitroのリン酸化反応実験によりMEK1の下流の因子であるERKがBcl-2ΔTMの87番目のセリンをリン酸化することが確かめられた。このリン酸化部位は、細胞内におけるリン酸化部位と一致していた。一方で、野生型Bcl-2とBcl-2ΔTMの双方がERKと結合できるが、野生型Bcl-2はミトコンドリアでPP2Aと複合体を形成していることから恒常的なリン酸化が観察されないことが分かり、Bcl-2ΔTMはPP2Aと結合できないことから恒常的にリン酸化されている事が分かった。さらに、正常ヒト血液由来Bcl-2は恒常的にリン酸化されており、培養がん細胞でのそれは脱リン酸化体であることが確かめられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13470053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / 発生 / EAT遺伝子 / ES細胞 / コンディショナル・ターゲッティング / bcl-2ファミリー / 遺伝子改変マウス / EAT / bcl / mcl-1 / mcl1 / トランスジェニック・マウス / ミトコンドリア / 細胞死

【研究成果の概要】

EAT/mcl1遺伝子は、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子として単離され、bcl-2関連遺伝子に属する。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制すること、本遺伝子を過剰発現するトランスジェニック・マウス(Tg)では、膵ラ氏島の過形成が生じることが知られている。本研究では、EAT/mcl1の発生段階および個体レベルでの機能を更に詳細にするために、胚性幹細胞(ES細胞)においてEAT/mcl1を欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行った。
Cre-loxPシステムを用いてEAT/mcl1遺伝子をマウス個体、ES細胞においてコンディショナルにノックアウトするために、EAT/mcl1のexon 1をloxPで挟むような変異を導入するターゲッティング・ベクターを導入することによりES細胞(TT2細胞)の一方の対立遺伝子に変異を導入することに成功した。11個のES細胞のクローンが得られ、5個のES細胞をマウス初期胚(胚盤胞)へ注入することによりキメラマウスを得た。それらより3ラインのマウスのラインを確立した。これらのマウスをCre recombinaseを発現するトランスジェニック・マウスと交配することにより以下のマウスを得た。1)EAT/mcl1のexon 1が破壊されたマウス(EAT/mcl1遺伝子1個のみ破壊されたヘテロ接合性のノックアウトマウスであり、表現形は、現在のところ、形態学的には野生形と同様と考えられる。このことはEAT/mcl1の発現量が通常の1/2となってもマウスは、正常に発生.分化することを示唆している)。2)EAT/mcl1のexon 1の両端にloxP配列が挿入されたマウス(このマウスは、両アレルとも正常なEAT/mcl1を有するが、臓器特異的Creトランスジェニック・マウスの交配により、コンディショナル・ノックアウトを作成することが可能である)。また、MEOXマウス(胎生5日目以降に、胚盤葉上層(将来、胎仔となる領域)特異的にCre recombinaseを発現するマウス)の導入を終了した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2004

【配分額】14,100千円 (直接経費: 14,100千円)

【研究分野】水産化学

【研究領域課題番号】12460092 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脂質過酸化 / リン脂質 / 細胞死 / ミトコンドリア / 膜電位 / 化学発光 / 蛍光 / 筋肉 / 脂質酸化 / アポトーシス

【研究成果の概要】

水産動物でも,個体死の後も細胞はしばらくの間生体活動を続けようとする.したがって,この間の取扱がその後の死後変化に大きな影響を及ぼす可能性がある.そこでまず,水産動物の個体死から細胞死に至る過程で生じる生物学的・化学的変化をモニターする手法を確立した.すなわち,本年度研究では,これらの手法を用いて生物学的・化学的変化をモニターすることにより,細胞死過程における動的変化の発現機構の解明とこれらの技術を応用した新たな鮮度判定法の確立を目指した.まず,生物学的アプローチとして急性摘出した魚類筋細胞ミトコンドリアおよび甲殻類筋細胞ミトコンドリアに膜電位感受性蛍光プローブJC-1あるいはrhodamine123を取り込ませてミトコンドリア膜電位の評価を行った.急性摘出したコイの筋細胞にJC-1を取り込ませた後,4時間まで窒素曝気したリンゲル液中においたところ,経時的に蛍光強度が減弱した.これは,低酸素状態に置かれたミトコンドリアの膜電位が低下し,ATP産生能も低下していることを示す.この細胞を十分に空気曝気したリンゲル液に戻すとミトコンドリアの蛍光が回復した.すなわち,コイ筋細胞は4時間もの間低酸素状態に置かれても少なくともミトコンドリアレベルでは生命維持活動が可能であることを示すものと思われる.また,イセエビ筋細胞にRohdamine123を投与し,ミトコンドリアに取り込ませた後,リンゲル液に十分通気しておけばミトコンドリア膜電位が少なくとも24時間以上維持される可能性が示された.このように,ミトコンドリアの膜電位およびその回復能をもって生命維持活性の評価ができるものと考えられた.さらに,12年度に確立した化学発光HPLCフローシステムを用いて,活魚の鮮度変化について検討した.ヒラメやマダイなどを即殺後,普通筋,血合筋,肝臓などの部位に分け,ホモジネート後、0℃で保存試験を行った.経時的にFolchの方法に準じて全脂質を抽出し,低温下で溶媒を留去後,過酸化物の定量分析を行った.HPLCフローシステムによる測定では,筋肉脂質よりも肝臓脂質の方が高い傾向が示されたが,リン脂質過酸化物の定量に再現性が乏しく,時間経過との相関はみられなかった.原因は全脂質中のリン脂質画分の低濃度にあると推定された.以上の結果から,細胞死をモニターするという新しい概念に基づいた鮮度判定手法として,ミトコンドリア膜電位測定および脂肪酸過酸化物の微量測定が適用できるものと結論された.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】14,200千円 (直接経費: 14,200千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】08407016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Kupffer 細胞 / 類洞壁細胞 / エンドトキシン / 酸化ストレス / アセトアルデヒド / ミトコンドリア / Kupffer細胞 / NO / TNFα / NF-kB / 肝疾患 / 接着因子 / カルシウム / NF-κB / アポトーシス

【研究成果の概要】

本研究では各種の実験的肝障害モデルにおいて類洞壁細胞群、特にKupffer細胞からの活性酸素やNOの放出動態と肝細胞障害特に類洞壁細胞の障害、アポトーシスなどを時間的空間的な相関とその制御機構を解明することを目的とした。
ラットKupffer細胞と肝癌細胞を共培養した実験系におい接着因子(CD18/ICAM-1)に依存性にCaの動員があり、それに引き続き肝細胞内において活性酸素の産生がおきることを明らかにした。さらに,癌細胞と共培養したKupffer細胞ではiNOSとiNOSのmRNAの増加を蛍光法を用いて明らかにした。そして、NOの産生に先立ってfluorescence in situ hybridization法により観察したNFkBの活性化とその核内への移動を明らかにした。また、エンドトキシンにより刺激したKupffer細胞と肝細胞を共培養するとKupffer細胞からNOとTNFαが放出され肝細胞におけるミトコンドリア機能が傷害されることを明らかにした。
アルコールによる肝障害では、潅流肝モデルにおいてアルコール投与によりKupffer細胞から肝類洞ヘスーパーオキサイドアニオンが放出され、それが類洞壁細胞の障害をきたしていることを明らかにした。また、Kupffer細胞自身にエタノール代謝能があり、その代謝にはcytochrome P4502E1が関与していることを明らかにした。生体顕微鏡下の観察により慢性的にエタノールを投与したラットにおいてはエンドトキシンによる肝微小循環障害がおきやすいことを明らかにし、その際に白血球の膠着が観察され、接着因子が重要な役割を果たすことを明らかにした。慢性エタノール投与後のラットではGRO/CINC(ラットIL-8)およびTNFの上昇を認め、白血球上にはLFA-1の表出が対照群に比して増強していることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】27,200千円 (直接経費: 27,200千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】07670613 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝癌 / Kupffer細胞 / NO / TNF-α / NF-κB / 接着因子 / apoptosis / 共焦点レーザー顕微鏡 / 活性酸素 / Nitric Oxide (NO) / ミトコンドリア / アポトーシス

【研究成果の概要】

初年度(平成7年度)においては、Kupffer細胞によるNO・TNF-α放出動態と肝癌細胞障害・アポトーシスとの時間的空間的相関およびその制御機構を解明してきた。すなわちKupffer細胞と肝癌細胞の共培養系におけるNOおよびTNF-α産生動態の定量と、肝癌細胞内ミトコンドリア呼吸能の変化、細胞膜・核膜障害、DNA fragmentation化を共焦点レーザー顕微鏡下に可視化、定量するシステムを確立した。次年度(平成8年度)においては、NO・TNF-α合成系の関与を裏付けるためにinducible NO synthase(iNOS)mRNAおよびTNF-α mRNAに対するアンチセンスプローブを用いて抑制実験を行なったほか、fluorescence in situ hybridization(FISH)法を応用し培養細胞内iNOSおよびTNF-α mRNAの誘導を確認した。さらに各種接着因子(ICAM-1、CD18等)に対するモノクローナル抗体を用いて上述の実験系に対する抑制実験を行った。以上の結果、肝癌細胞とのICAM-1、CD18を介した接着によりKupffer細胞のNO・TNF-α合成が増加し、肝癌細胞にnecrosisのみならずapoptosisが惹起されることが明らかとなった。さらに共焦点レーザー顕微鏡的観察と組み合わせたFluorescence in situ DNA-protein結合法の開発により活性化した転写因子(NF-κ B)がKupffer細胞におけるiNOS mRNAおよびTNF-α mRNAの誘導に関与していることを証明することに成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1995 - 1996

【配分額】2,500千円 (直接経費: 2,500千円)