Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

アポトーシス / RNA結合蛋白質 / KHドメイン / p53 / TGF-beta / エストロジェン / TPA / splicing / D8 / TGF-b / Bim / 3'-UTR / ノックアウトマウス / PNA

新規PNA結合蛋白質D8がアポトーシスを誘導する活性をもつことを見出しその分子機構を解析した。
1)D8はDNAストレスによるアポトーシズの誘導に重要な役割を果たしていることを見出した。
2)ルシフェラーゼ・アッセイ、クロマチン免疫沈降法によりD8のプロモーターがp53やTGF-betaシグナルにより直接に転写活性化されることを明らかにした。
3)D8がアポトーシスを誘導するためには、RNA結合活性をもつKHドメイン1,2両方が必要であった。
4)Bimの誘導がD8によるアポトーシス誘導に重要であることを明らかにした。
5)D8にエストロジェン受容体が結合し、mRNAのsplicingに関与することを示唆する結果を得た。
6)D8以外に染色体1,18,19に存在するファミリーを同定し、TPAによって発現誘導されることを見出した。

GTP結合タンパク質 / ERA / RNA結合タンパク質 / アポトーシス / ミトコンドリア

昨年度の当該研究において、ERAはミトコンドリアに局在するGTP結合タンパク質であることが判明した。そこで、本年度はミトコンドリアにおけるERA複合体の同定および昨年度に引き続いてERA欠損マウスの作製を行った。
1、ERAを含むタンパク質複合体の精製およびその構成因子の同定
FlagおよびHisを付加したERAの安定発現HeLa細胞株を樹立し、その細胞からミトコンドリア粗抽出液を調整した。その後、抗Flag抗体を用いた免疫沈降、Niレジンを用いたアフィニティ精製を行うことで、高精製度のERAタンパク質複合体を得ることに成功した。さらに、その複合体をSDS-PAGEで分離し複数の複合体構成分子由来のバンドを検出したのち、ゲルよりそれら構成分子を単離し MALDI-TOF-TOF/MSを用いた質量分析を行うことで、ERA複合体構成因子の同定に成功した。その結果、ERAはミトコンドリアでのタンパク質合成や細胞死制御に関与する因子と複合体を形成していることが判明した。
2、ERA欠損マウスの作製
昨年度、マウスERAゲノムのクローニングを行った。本年度は、Cre-loxP systemを用いたERA遺伝子のコンディショナルターゲッティングベクターを作製した。作製したターゲッティングベクターをマウスES細胞に導入し相同性組み換えを起こさせ、ERAヘテロ欠損ES細胞の樹立に成功した。現在、樹立したES細胞を用いてキメラマウスの作製を行っている。

RNA結合蛋白質 / p53 / TGF-β / アポトーシス / Bim / KHドメイン / 標的遺伝子 / ノックアウトマウス / TPA / 発現誘導

p53およびTGF-βによって発現誘導される新規遺伝子D8を見出し、以下の事実を明らかにした。
1)D8をHepG2などの癌細胞に強制発現するとアポトーシスを誘導する。RNAiを用いてD8の発現を抑制するとp53やTGF-βによるアポトーシスの誘導が阻害される。これらの結果から、D8はp53やTGF-βによるアポトーシスの誘導に重要な役割を果たしていると考えられた。
2)5FU、アドリアマイシンなどによりゲノムの損傷をうけるとD8の発現が増加すること、これらの薬剤によるアポトーシスにD8が重要な役割をはたしていることを見出した。
3)BH3 onlyファミリーに属すBimがD8のKHドメインに結合することを見出した。RNAiを用いてBimの発現を抑制するとD8によるアポトーシス誘導が阻害されることから、BimはD8によるアポトーシス誘導に重要な役割を果たしていると考えられた。
4)D8はアポトーシスを誘導する活性のあるBimのmRNAを安定化することによりアポトーシスを誘導していると考えられた。
5)D8ノックアウトマウスの作成を進めた。
6)D8と相同性が高くドメイン構造も類似した3種類のタンパク質をコードする遺伝子(D8-2、D8-3およびD8-4)が存在し、D8ファミリーを構成していることを見出した。D8ファミリーの各cDNA全長を単離し全構造を明らかにし、ノックアウトマウスの作製を進めた。

GTP結合タンパク質 / 細胞周期 / アポトーシス / RNP Kホモロジードメイン / RNA結合タンパク質 / DT40 / 細胞増殖 / アポートシス / 遺伝子破壊 / Gタンパク質 / 翻訳後修飾

アポトーシス及び細胞周期の進行制御の関与すると予想されるGTP結合タンパク質ERAのヒトおよびマウスホモログの完全長cDNAクローニングを行った。ついでヒトERAの生理機能及びその作用機構の解明を目指し以下の結果を得た。
(1)ERAはRNA結合タンパク質である。
ERAのC末端側にはRNA結合能を有すると考えられるhn RNP K homology(KH)ドメインが存在する。リコンビナントERAタンパク質とランダムRNAを混合したところ両者の結合が確認された。ERAのRNA結合能はKHドメインを欠損させることにより消失した。KHドメイン欠損がERAの過剰発現によるアポトーシス誘導をも抑制することからERAの生理機能にそのRNA結合能が重要であると考えられた。アポトーシス誘導シグナルにRNAが関与するという報告はなく、新しい細胞生存制御の分子メカニズムが想定された。この内容は学術誌および各種学会において公表した。
(2)ERAは細胞周期進行および細胞の生存に必須である。
ERAの細胞増殖・生存における機能を調べるため、era遺伝子を欠損したニワトリDT40細胞株を樹立した。ERAを欠損した細胞は増殖が著しく低下すると伴にG1期の細胞が増加し、続いてアポトーシスが誘導された。またERA欠損細胞株で観察される表現型は野生型ERA導入により完全に相補されるが、RNA結合ドメインであるKHドメインを欠失したERAでは相補されなかった。この事実はERAが細胞増殖・生存をRNA結合ドメインを介し正に制御することを強く示唆している。これらの結果はすでに各種学会にて報告し、学術誌に印刷中である。