【研究分野】腎臓内科学

【研究領域課題番号】16K09605 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

慢性腎臓病 / 炎症 / 尿細管細胞 / 解糖系 / Mint3 / 尿細管間質傷害 / 低酸素 / NF-κB / アポトーシス / 代謝リプログラミング / 2-デオキシグルコース / マクロファージ

【研究成果の概要】

細胞の代謝経路の一つである解糖系を阻害する２－デオキシグルコースの投与でマウスの両側腎虚血再灌流傷害が軽減されることが示された．これは同薬剤が尿細管細胞の脂肪酸のβ酸化やペントースリン酸回路を亢進し，ATPが増加するためである．また，Mint3という分子は，尿細管細胞でNF-κBの作用を亢進を介して抗アポトーシス作用をもつ分子の発現を増加させることで，慢性腎臓病における尿細管細胞のアポトーシスを抑制し，マウスの腎線維化を抑制するはたらきをもつことが示された．

【研究の社会的意義】

慢性腎臓病には根本的治療がなく，そのため透析導入などに繋がっている．そこで慢性腎臓病の進行に関わる炎症についてその機序の解明を目指し，主に二つのことを見出した．一つは，解糖系の阻害により腎尿細管細胞の代謝を変容させると，腎障害を軽減しうることである．二つめは，Mint3という分子がNF-κBを介してアポトーシスという細胞死を抑制することで，尿細管傷害を減弱し，慢性腎臓病の線維化を抑制することである．これらのことから，マクロファージなどの炎症細胞だけでなく，炎症を惹起する尿細管細胞などの上皮細胞傷害も炎症に重要な役割と果たすことが明らかとなった．

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】膠原病・アレルギー・感染症内科学

【研究領域課題番号】16659266 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロスタグランジン / NF-κB / NAK / IKK / 炎症 / アポトーシス

【研究成果の概要】

本研究はNF-kB活性化に重要な役割を持つIKKおよびIKK活性化酵素であるNAKを標的として、新規阻害剤を開発することを目的として行われた。新規阻害剤に対するシーズ化合物として、IKK阻害活性を持つアスピリンおよびJ型プロスタグランジン(PGJ)を用いた。アスピリンを基本骨格として10種類程度の誘導体を化学合成し、in vitroおよびin vivoにおいてIKK阻害活性あるいはNF-kB活性化阻害作用を検討したが、アスピリンと同等以上の阻害活性をもつ化合物は得られなかった。一方、PGJを基本骨格とした誘導体を20種類程度化学合成して上記と同様にIKK阻害活性およびNF-kB活性化阻害活性を検討したところ天然型PGJと比較して10倍程度高活性を持つ新たな誘導体が得られた。本誘導体は細胞内において、リコンビナントIKKと同様に複合体を形成するIKKに対しても阻害効果を示し、また細胞に投与するとTNF-aあるいはIL-1b刺激によるNF-kB活性化を顕著に抑制した。以上の結果から、本研究により合成された新規誘導体は天然型PGJに比較して非常に高活性を持つ薬物と考えられ、今後新たな抗炎症剤として開発することを目的に、体内動態あるいは個体レベルでの抗炎症効果等を検討していく予定である。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2004

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】泌尿器科学

【研究領域課題番号】16390469 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

NF-κB / 泌尿器系癌 / アポトーシス / 転移 / 悪液質 / 前立腺癌 / 放射線治療 / 細胞周期 / IL-6 / STAT3 / 膀胱癌 / 殺細胞効果

【研究成果の概要】

NF-κBは炎症性サイトカインや抗アポトーシス蛋白の誘導など様々な生体反応に関与している転写因子であり、泌尿器科系悪性腫瘍においても、癌の進展や転移、抗癌剤や放射線治療に対する抵抗性、悪液質などの腫瘍随伴症候群など様々な病態生理に関与していると想定される。dehydroxymethylepoxyquinomicin(DHMEQ)は新規に合成された強力なNF-κB阻害である。NF-κBはホルモン抵抗性前立腺癌や浸潤性膀胱癌において恒常的に活性化されており、DHMEQはNF-κB活性を抑制し、アポトーシスを誘導することを見出している。さらには前立腺癌の放射線抵抗性においてNF-κBの活性化が重要な役割を果たしており、DHMEQで前処置することにより放射線感受性を高めることが示され、その効果はG2/M cell cycle arrestを介するものであった。さらにはサイトカイン産生膀胱癌細胞であるKU-19-19細胞に対してアポトーシスの誘導と血管新生阻害を介して抗腫瘍効果を示すことを見出した。また、MBT-2細胞を用いた肺転移モデルにおいてもDHMEQが肺転移を抑制することが示された。一方、進行性前立腺癌患者ならびにJCA-1担癌マウスにおいて、NF-κB依存性サイトカインであるIL-6の血清濃度が増加しており、IL-6が血清アルブミンやコレステロール値、ヘモグロビン濃度やbody mass indexさらには生存率などと関連していることが示された。担癌マウスにおいてDHMEQは血清IL-6を抑制し、悪液質を改善した。このように、DHMEQによるNF-κB活性の抑制は進行性泌尿器系癌に対する新たな分子標的治療となりうることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】13,500千円 (直接経費: 13,500千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】16390024 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TNFシグナル / TRAF6 / NF-κB / 接着斑キナーゼ / DNAマイクロアレー / MALDI-TOF / MS / アポトーシス / FAK / FAK過剰発現

【研究成果の概要】

本プロジェクトはシグナル伝達に関わる分子群に焦点をあて分子間相互作用を明らかにするとともに、これを標的とする薬物の開発につながる研究の展開を計った。具体的には、接着斑キナーゼFAKやTRAF6がそのサイトカイン産生やアポトーシスを制御する重要なシグナル分子であることから、FAKならびにTRAF6欠損細胞を用いて、TNFαや酸化ストレスによるアポトーシス誘導やサイトカイン産生の解析を行うとともに、新規薬物の作用解析を行った。本年度を含む、3年間のまとめとして、以下の知見が得られた。
1.FAKのTNFα誘導アポトーシスに対する耐性機序の解析:FAK欠損細胞ではFAK+/-細胞に比べ細胞死が起こりやすく、カスパーゼの活性化とJNKの活性化が容易に見られることを明らかにした(Takahashi et al. 2007) 2.TRAF6欠損細胞におけるアポトーシス誘導とそのシグナル分子の解析:TRAF6欠損細胞では、TNFαによりアポトーシスが誘導されやすく、TRAF6が細胞死から保護することを見い出し、その分子機構を明らかにした(Ichikawa et al. 2006)。3.神経変性疾患にみられる神経細胞死の分子シグナル機構の解析:神経細胞死に至る分子メカニズムをとくにオルガネラからの視点から考察し、その分子機構を明らかにした(Murakami et al. 2007)。また、4.グリチルリチンとその誘導体の炎症性サイトカイン産生誘導シグナルに及ぼす効果の検討、5.抗がん剤による細胞死に至るシグナル解析とSUMO化との関連、6.マウスメラノーマ細胞の転移に関わるシグナル分子の同定と解析、を行った。
これらのシグナル関連分子群の解析は、抗炎症薬や抗がん剤による作用の新たな解析とともに、新たな薬物の開発の基盤を与える有力な手がかりになるものと考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】10,400千円 (直接経費: 10,400千円)

【研究分野】臨床獣医学

【研究領域課題番号】15208030 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

犬乳腺腫瘍細胞株 / 猫乳腺腫瘍細胞株 / 犬肥満細胞腫 / 接着因子 / レチノイド / E-カドヘリン / マイクロアレイ / 転移浸潤 / NFκB / 犬乳癌細胞株 / 猫乳癌細胞株 / sLe(X) / 細胞接着 / E-Cadherin / sLe(x) / E-cadherin / RARα / 乳癌細胞 / 肥満細胞腫細胞 / Brca2遺伝子 / CXCR4 / SDF-1 / アポトーシス

【研究成果の概要】

本研究では、我々が実際の症例から樹立した犬の乳癌細胞株、猫の乳癌細胞株、犬の肥満細胞腫細胞株、犬の骨肉腫細胞株、犬の悪性メラノーマ細胞株の5種類を用い、これらの腫瘍の浸潤能、転移能に関与する因子の解明を試みた。
犬の乳癌細胞株は同一症例の原発巣と転移巣からそれぞれ樹立した4ペアの細胞を用い、接着因子であるE-cadherin-catenin系の解析を行った。これらの細胞における発現には差がなかったが、cadherin機能の面では、転移巣由来細胞が原発巣由来の細胞より高く、原発巣から遊離した細胞がより転移しやすいことを示す、従来の説を支持する結果であった。さらに、これらの細胞に対し、従来から浸潤・転移に関わるとされている24の因子についても解析したが、転移巣/原発巣由来細胞株間に明確な差はみられなかった。しかしその中で、シアリルルイスX(sLe(x))に関しては、転移性胸水由来の細胞で強い発現がみられ、かつ、性状乳腺組織には発現がなく、乳癌組織には約60%で発現することから、肺転移時の血管内皮への接着に関与する可能性が示唆された。現在。クローン化した乳癌細胞を用いたマイクロアレイによって、さらに転移・浸潤関連因子の探索を継続している。
一方、猫の乳癌に関しては、ケモカインレセプタアーCXCR4およびそのリガンドSDF-1が転移巣由来細胞でより高く発現することから、これも転移関連因子である可能性が示唆された。
犬の肥満細胞腫に関しては、レチノイドの抗腫瘍効果を確認し、さらにそれが人の前骨髄性白血病と同様、レセプターRARαを介して生じている可能性を示した。さらに、臨床試験において、レチノイドは一つの有力な化学療法剤になりうる可能性を示し、今後、他の抗腫瘍薬、グルココルチコイドとの併用による新規治療法の開発につながるものと考えられる。
犬の骨肉腫に対しては、犬のワイルドタイプP53によるアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療を試みた。その結果、in vitroでは明らかに腫瘍細胞内へのp53取り込みが認められ、また症例の1頭では部分的な縮小を示した。一方、メラノーマに対しては、やはり腫瘍の悪性度と関連する染色体不安定性に着目し、今後検討を進める予定である。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2003 - 2006

【配分額】52,390千円 (直接経費: 40,300千円、間接経費: 12,090千円)

【研究分野】泌尿器科学

【研究領域課題番号】15591715 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

腎細胞癌 / サイトカイン / アポトーシス / NF-κB / C / EBP / AP-2 / MAPキナーゼ / Akt / EBP-β

【研究成果の概要】

サイトカインのシグナル伝達に関連した転写因子に着目して腎細胞癌の細胞生物学的特徴を明らかにした。一連の研究は腎細胞癌が頻繁に発熱や白血球増多症を伴い、サイトカイン産生性腫瘍であるという臨床的特性に対する分子基盤を与える研究と位置づけられる。腎細胞癌の組織においてはNF-κBの活性化は腫瘍の進展や転移と関連すること(Oya M et al : Carcinogenesis 2003)、CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)の活性化は腎細胞癌においてはβサブタイプに依存していること(Oya M et al : Clin Cancer Res 2003)を示した。これら2つの転写因子の活性化は癌の悪性度や浸潤と相関するのに対し、Activator protein 2(AP-2)は逆に早期の腎細胞癌に有意に活性化が見られることを示した(Oya M et al : Urology 2004)。さらに腎細胞癌のアポトーシスの誘導機構を利用して治療への応用を試みた。Mitogen-activated protein kinase(MAPK)とphosphatidylinositol-3-OH kinase(PI3K)-Akt経路の意義を中心に解析した。MAPKは主にERK,JNK,p38の経路に分類される。腎細胞癌においてはJNKの活性化を負に制御するフォスファターゼであるMKP-1の発現の亢進が存在し、JNKの活性化はすみやかに抑制されること、JNKの活性化を持続させることにより腎細胞癌においてアポトーシスが誘導されることを示した(Mizuno R et al : J Urol 2004)。また、プロテアソーム阻害剤が腎癌細胞にアポトーシスを誘導することを示した(Ishizawa J et al : Int J Oncol 2004)。PI3K-Akt経路の解析では免疫組織化学的手法にてAktの活性化が腎細胞癌の予後不良因子であることを示した(Horiguchi A et al : J Urol 2003)。これらの成果は分子標的治療への応用が期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】泌尿器科学

【研究領域課題番号】13470341 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

bcl-2 / NFkappaB / 泌尿器系癌 / STAT3 / 分子標的 / 前立腺癌 / NFκB / アポトーシス / 腎細胞癌 / TRAIL / NF-κB

【研究成果の概要】

腎細胞癌において癌の進行と比例してNFκBの活性化が認められた。腎細胞癌培養細胞においてNFκBの特異的な抑制因子であるIκBαのcDNA(AxIκBαΔN)を導入することにより増殖が抑制された。これら感受性の細胞株ではカスパーゼ活性の増強とアポトーシスの誘導を認めた。NFκBの恒常的活性化が生じている細胞はTRAILに非感受性であり、TRAILの感受性とAxIκBαΔNの感受性とは逆相関した。膀胱癌細胞株やホルモン非依存性前立腺癌細胞株においてNFκBが活性化されており、新規に開発されたNFκB阻害剤であるDHMEQはNFκB活性を抑制するとともにアポトーシスを誘導した。アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞においてbcl-2が発現しており、antisense bcl-2 oligodeoxynucleotideはアポトーシスを誘導し、さらにはdiethylstilbestrolの殺細胞効果を増強した。CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)は細胞の分化誘導に関する遺伝子およびサイトカインの発現を制御する転写因子群であるが、局所浸潤を認める腎癌では限局性の腎癌に比べて活性が有意に増強しており、C/EBPβの活性化は腎細胞癌の浸潤性増殖と関連し、新たな治療に結びつく可能性が示唆された。腎細胞癌培養細胞においてIL-6がSTAT3のDNA bindingを増加させ、IL-6による腎細胞癌の増殖刺激においてSTAT3が重要な役割を果たしていることが示された。さらにはJakに特異的な阻害剤であるAG490はIL-6により誘導されるSTAT3の活性化を抑制し、アポトーシスを誘導し、STAT3のsignal pathwayを抑制することが腎細胞癌に対する新たな治療戦略となりうることがしめされた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】14,300千円 (直接経費: 14,300千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】08407016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Kupffer 細胞 / 類洞壁細胞 / エンドトキシン / 酸化ストレス / アセトアルデヒド / ミトコンドリア / Kupffer細胞 / NO / TNFα / NF-kB / 肝疾患 / 接着因子 / カルシウム / NF-κB / アポトーシス

【研究成果の概要】

本研究では各種の実験的肝障害モデルにおいて類洞壁細胞群、特にKupffer細胞からの活性酸素やNOの放出動態と肝細胞障害特に類洞壁細胞の障害、アポトーシスなどを時間的空間的な相関とその制御機構を解明することを目的とした。
ラットKupffer細胞と肝癌細胞を共培養した実験系におい接着因子(CD18/ICAM-1)に依存性にCaの動員があり、それに引き続き肝細胞内において活性酸素の産生がおきることを明らかにした。さらに,癌細胞と共培養したKupffer細胞ではiNOSとiNOSのmRNAの増加を蛍光法を用いて明らかにした。そして、NOの産生に先立ってfluorescence in situ hybridization法により観察したNFkBの活性化とその核内への移動を明らかにした。また、エンドトキシンにより刺激したKupffer細胞と肝細胞を共培養するとKupffer細胞からNOとTNFαが放出され肝細胞におけるミトコンドリア機能が傷害されることを明らかにした。
アルコールによる肝障害では、潅流肝モデルにおいてアルコール投与によりKupffer細胞から肝類洞ヘスーパーオキサイドアニオンが放出され、それが類洞壁細胞の障害をきたしていることを明らかにした。また、Kupffer細胞自身にエタノール代謝能があり、その代謝にはcytochrome P4502E1が関与していることを明らかにした。生体顕微鏡下の観察により慢性的にエタノールを投与したラットにおいてはエンドトキシンによる肝微小循環障害がおきやすいことを明らかにし、その際に白血球の膠着が観察され、接着因子が重要な役割を果たすことを明らかにした。慢性エタノール投与後のラットではGRO/CINC(ラットIL-8)およびTNFの上昇を認め、白血球上にはLFA-1の表出が対照群に比して増強していることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】27,200千円 (直接経費: 27,200千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】07670613 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝癌 / Kupffer細胞 / NO / TNF-α / NF-κB / 接着因子 / apoptosis / 共焦点レーザー顕微鏡 / 活性酸素 / Nitric Oxide (NO) / ミトコンドリア / アポトーシス

【研究成果の概要】

初年度(平成7年度)においては、Kupffer細胞によるNO・TNF-α放出動態と肝癌細胞障害・アポトーシスとの時間的空間的相関およびその制御機構を解明してきた。すなわちKupffer細胞と肝癌細胞の共培養系におけるNOおよびTNF-α産生動態の定量と、肝癌細胞内ミトコンドリア呼吸能の変化、細胞膜・核膜障害、DNA fragmentation化を共焦点レーザー顕微鏡下に可視化、定量するシステムを確立した。次年度(平成8年度)においては、NO・TNF-α合成系の関与を裏付けるためにinducible NO synthase(iNOS)mRNAおよびTNF-α mRNAに対するアンチセンスプローブを用いて抑制実験を行なったほか、fluorescence in situ hybridization(FISH)法を応用し培養細胞内iNOSおよびTNF-α mRNAの誘導を確認した。さらに各種接着因子(ICAM-1、CD18等)に対するモノクローナル抗体を用いて上述の実験系に対する抑制実験を行った。以上の結果、肝癌細胞とのICAM-1、CD18を介した接着によりKupffer細胞のNO・TNF-α合成が増加し、肝癌細胞にnecrosisのみならずapoptosisが惹起されることが明らかとなった。さらに共焦点レーザー顕微鏡的観察と組み合わせたFluorescence in situ DNA-protein結合法の開発により活性化した転写因子(NF-κ B)がKupffer細胞におけるiNOS mRNAおよびTNF-α mRNAの誘導に関与していることを証明することに成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1995 - 1996

【配分額】2,500千円 (直接経費: 2,500千円)