【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】16390432 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

破骨細胞 / Rac1 / M-CSF / Akt / アポトーシス / 低分子量Gタンパク質 / アデノウイルスベクター / 骨吸収

【研究成果の概要】

破骨細胞は最終分化した増殖能のない細胞であり、一旦分化するとreceptor activator of NF-kB ligand(RANKL)やマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)などの生存因子が存在しないと速やかに細胞死に至る。破骨細胞の細胞死はアポトーシスによるものであることが報告されている。アポトーシスは「プログラムされた細胞死」とも呼ばれ、細胞への様々な刺激、あるいはストレスなどによって誘導され、DNAの断片化を特徴とする静かな細胞死である。近年破骨細胞の細胞死はアポトーシスによることが明らかになってきたが、このように骨代謝の要ともいえる破骨細胞がなぜアポトーシスに陥りやすいのか、またその分子メカニズムはいかなるものか、などについてはほとんど明らかになっていないのが現状である。ビスフォスフォネートは強力な骨吸収抑制作用を有する骨粗鬆症治療薬であるが、その作用メカニズムとして破骨細胞のアポトーシス誘導が知られている。われわれはこれまでにsmall G proteinのひとつであるRasが破骨細胞の生存に重要であり、Rasの活性を抑制するdominant negative Ras遺伝子の導入によって破骨細胞は速やかにアポトーシスに陥り、Ras-ERK経路を活性化するconstitutively active MEK1の導入によってアポトーシスが強力に抑制されることを明らかにした。やはりsmall G proteinであるRhoファミリーに属するRac1はラメリポディアの形成などアクチン細胞骨格の制御に重要な働きをすると考えられているが、ある種の細胞ではアポトーシスシグナルに関与することが明らかになっている。われわれは破骨細胞のアポトーシスにおけるsmall G protein、なかでもRho,Rac,Cdc42といったRhoファミリーの役割を明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】9,600千円 (直接経費: 9,600千円)

【研究分野】呼吸器内科学

【研究領域課題番号】15590799 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

COPD / 遺伝子治療 / Glutathione S-transferase P1 / Klotho遺伝子 / 慢性喫煙 / アデノウイルスベクター / アポトーシス / 慢性閉塞性肺疾患(COPD) / 肺気腫 / グルタチオンSトランスフェラーゼ

【研究成果の概要】

Glutathione S-transferase P1 (GSTP1)はGSTのサブタイプ一つで、毒性物質に対するグルタチオン抱合を触媒する。Glutathione (GSH)は哺乳動物において最も豊富な細胞内抗酸化物質であり、多くの酵素機能や免疫能の維持に必須の重要な蛋白質である。GSTP1は、このGSHの代謝に関わるわけではなく、GSHの酵素機能の調節に主に関わっている。GSTP1は肺胞、肺胞マクロファージや呼吸細気管支において他のGSTよりもより強く発現していることが報告されており、肺気腫が形成される末梢気道において重要な役割を果たしている可能性がある。そこで、GSTP1についてCOPDとのassociation studyを行ったところ、exon-5における105Ile genotypeとCOPDとの関連が示唆された。このGSTP1遺伝子多型のCOPD発症への意義を確立するためには、本来ならば、この遺伝子多型毎に喫煙負荷量をマッチさせた群を前向きに、呼吸機能などで評価追跡すべきである。しかし、病的な気流閉塞を証明するためには喫煙を続けても20年以上の経過観察が必要であり、実際的ではない。そこで、GSTP1蛋白機能のない個体を用いて喫煙負荷研究を行うため、英国で開発されたグルタチオンS-トランスフェラーゼP1/P2(GSTP1/P2)欠損マウスを移入した。マウスのGSTPは、GSTP1、GSTP2がクローニングされており、両者は2.5kb間隔でタンデムに位置している。GSTP1を欠失させ、GSTP2をtruncatedしたコンストラクトを作成し、ES細胞に遺伝子導入し、両遺伝子の発現がES細胞中に見られないことを確認し、マウスを作成した。
マウスのGSTPはGSTP1遺伝子発現がGSTP2発現量をはるかに上回るため、両者を欠失させた場合その影響は、主にGSTP1遺伝子発現がないものと考えてよい。本研究では、GSTP1/P2 null mouseに対する喫煙肺障害を検討した。その結果、慢性喫煙負荷によってGSTP1/P21 null mouseは肺気腫様の変化を生ずることが明らかとなった。したがって、ヒト個体における喫煙後の肺気腫形成のよいモデル動物と考えられ、同時にCOPD患者の病態研究に重要な情報を提供しえるものと考えられる。COPDには、慢性気管支炎、肺気腫があり、この2病型は肺組織の形態も病理も異なっている。加齢は万人に生ずるが、その結果生ずる老化というヘテロな病態に修飾されるCOPDは、遺伝的素因もさることながら、その後の病気を悪化せずに食い止める手立てがより重要であると考えられる。したがって、肺機能の悪化の早い患者群や、気管支拡張薬が奏効する患者群を選び出すような遺伝的解析が重要である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】生物系薬学

【研究領域課題番号】12672118 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポートシス / シグナル伝達機構 / 酸化ストレス / 接着斑キナーゼFAK / 抗アボートシス作用 / アポトーシス誘導阻止因子 / アデノウイルスベクター / 薬剤耐性機構 / アポトーシス / 抗アポトーシス作用 / 抗アポートシス作用

【研究成果の概要】

アボートシスに至るシグナル伝達機構の解析は細胞生物学の重要な課題であり,我々はこれまで単球と内皮細胞や腫瘍細胞と接着によるアボートシス誘導を見い出し,その関与分子を明らかにしてきた.また,酸化ストレスならびに抗がん剤によるアボートシスの誘導の際,接着斑キナーゼp125FAKがチロシンリン酸化され,この分子が抗アポートシス作用に重要な役割を持つことを示してきた.平成12年度は,(1)FAKの抗アポトシース経路には,Akt/PKB→NF-kB活性化→アポトーシス誘導阻止因子(IAP)ファミリー誘導の経路が関与することをヒト白血病細胞株HL-60,ならびにグリオーマ細胞株T98Gにおいて見い出した.さらに,(2)FAKの抗アボートシスにおける役割を明らかにするために,HL-60でFAK関漣遺伝子の過剰発現系を樹立を試みた.また,T98GではFAK遺伝子の安定導入株を得ると共に,アデノウイルスベクターを構築して,T98G細胞での高発現系を作成した.さらに,平成13年度は,(3)前年度の系を発展させ,FAK高発現系では酸化ストレスや抗がん剤によるアボートシスに高度耐性を示すことがわかり,そのアポトーシス耐性の機序を検討した.一方,Y397F変異FAK遺伝子を導入することにより,逆にアポトーシスを誘導することを見い出し,その機序の解析を行った.(4)酸化ストレスや抗がん剤,放射線によるアボートシス誘導時のカスパーゼファミリー(とくにカスパーゼ-1,3,6,8,9)の関与の解析を行った.このようなアポトーシス耐性機序の解析は,がん化学療法で問題となる薬剤耐性機構を明らかにする上でも極めて重要であると考える.なお,研究の成果の一部は,すでにJBC2000,BBRC2001,ARS2002などに発表または印刷中である.

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】11470157 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エストロゲン受容体 / 動脈硬化 / トランスジェニック・ラット / アデノウイルスベクター / 血管平滑筋細胞 / DNA chip / 内皮細胞 / 平滑筋細胞 / 増殖 / アポトーシス

【研究成果の概要】

本研究の目的は、エストロゲン受容体(ER)サブタイプの観点からエストロゲンの動脈硬化抑制作用を解明し、動脈硬化の新しい治療法開発へ応用することである。この3年間において最終的に以下の6つの成果をあげた。(1)糖尿病の動脈硬化への関与をERとの関連から検討し、血管平滑筋細胞で高グルコース状態がERαの発現を有意に低下させ、その機序にグルコースによるprotein kinase Cの活性亢進が関与することを示した。(2)ERαおよびERβ両方の転写機能に対してドミナント・ネガティブ効果を有する、我々が新規に開発した変異タンパクを過剰発現するトランスジェニック・ラットの作成に成功した。このラットにおいて、カフ装着による実験的動脈硬化モデルを作成し、ERの病態生理学的意義を明らかにした。(3)エストロゲンの血管平滑筋細胞の増殖を抑制する作用はERのどちらのサブタイプを介しているのかは不明であった。我々は、ERαとERβを培養血管平滑筋細胞に強制発現させる系を用い、その作用は主にERβを介していることを証明した。(4)動脈硬化の初期病変形成には、内皮細胞のアポトーシスが関連している。そこで、酸化ストレスによる血管内皮細胞のアポトーシスに対するエストロゲンの作用について検討し、エストロゲンはアポトーシスを減少させ、その機序の一部にBax蛋白の発現が関与していることを示した。(5)肥満は動脈硬化の重要な危険因子であるが、エストロゲンには肥満抑制作用がある。この機序としてのエストロゲンの中枢作用を検討し、中枢においてERβがエストロゲンの肥満抑制作用に関与していることを見いだした。(6)ERβの遺伝子上流のCA(cytosine-adenine)リピート多型と血圧の関連を、187人の健常閉経後日本人女性を対象に解析し、その中の一群において有意な収縮期高血圧が認められることを示した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】11,800千円 (直接経費: 11,800千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】10671346 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脊髄損傷 / アデノウイルス / MEKI / 脊椎損傷 / シュワン細胞 / PI3キナーゼ / アデノウィルスベクター / MEK / PC12 / アポトーシス

【研究成果の概要】

我が国には現在10万人以上の脊髄損傷患者がおり、さらに毎年約5千人の脊髄損傷患者があらたに生まれると予測されている。脊髄損傷は交通事故やスポーツによる20歳代の若年者の受傷が多いことが特徴であり、社会的にも大きな損失である。また、医療の進歩により脊髄損傷患者の長期生存が可能になった一方で、脊髄損傷による麻痺、疼痛に対して現状では完全な治療法がないため、患者は長期間にわたる闘病生活を余儀なくされている。脊髄損傷の本質的な治療を行うためには損傷後に中枢神経内でおこる反応のメカニズムを明らかにし、その反応を調節することによって神経細胞へのダメージ回復を図ることが重要である。哺乳類において脊髄損傷後、神経機能が不可逆的に失われる理由は神経軸索の再生能力が中枢神経内では乏しいためと考えられる。神経軸索伸長のメカニズムは明らかになっていないが、最近MAPキナーゼの1つであるERKの持続的な活性化が重要な役割を果たしていることが明らかになっている。本研究においてわれわれは恒常活性型のMEK1遺伝子をアデノウイルスを用いて発現させることにより(1)ラット褐色細胞腫由来のPC12細胞の神経突起伸長誘導が可能であること(2)ラット脊髄切断による脊髄損傷モデルにこのウイルスを感染させることにより神経軸索伸長が誘導され、四肢機能の回復が認められることを明らかにした。今後ERKを活性化させるような薬剤の開発、あるいは遺伝子治療によって脊髄損傷の回復を期待することができると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1998 - 2001

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,900千円)