【研究領域課題番号】18H02861 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膵臓β細胞 / ドパミン / VMAT2 / インスリン分泌 / 膵臓 / 内分泌細胞 / 血糖維持 / 分化 / 多能性幹細胞 / インスリン / 糖代謝 / 増殖 / 膵臓分化 / 内胚葉 / 糖尿病 / 分化誘導 / 恒常性維持 / 分泌

【研究成果の概要】

膵臓β細胞の恒常性維持の分子基盤の解明を目指し、膵臓β細胞特異的なVMAT2遺伝子変異マウスの解析を進めた。変異マウスでは、細胞内ドパミンが減少し、糖応答性インスリン分泌が上昇した。高脂肪食を給餌した条件では、β細胞の脱分化、β細胞死や耐糖能の悪化が認められた。詳細な解析の結果、糖応答性インスリン分泌とともにドパミンが分泌されるが、VMAT2の欠失β細胞では、再取り込みされたドパミンは分泌小胞に格納されずに、細胞内の分解酵素MAOにより分解され、ROSが発生する。高脂肪食条件では、インスリン分泌が亢進し、次第にβ細胞はROSにより脱分化、そしてβ細胞死が引き起こされることに至ることが分かった。

【研究の社会的意義】

VMAT2-ドパミンシグナルは膵臓β細胞の分化抑制シグナルとして働くのみならず、β細胞の量を制御するシグナルでもあり、糖応答性インスリン分泌を負に制御するシグナルである。一方、VMAT2-ドパミンシグナルを欠くと、糖応答性インスリン分泌が亢進した。高脂肪食給餌条件下では、β細胞特異的VMAT2遺伝子変異マウスは、対照の野生型よりも早く耐糖能の改悪を示し、β細胞の脱分化、脱落を引き起こした。これらの結果から、膵臓β細胞を正常に維持するためには、負に制御するシグナルが重要な役割を果たすことが示された。膵臓β細胞の恒常性維持のためには、その機能を適宜に制御することが重要であることが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】24390451 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ステムネスシグナル / 造血-間葉相互作用 / 間葉系幹細胞 / 造血幹細胞 / 造血－間葉相互作用 / 共培養 / 幹細胞特性（ステムネス） / 骨 / 増殖 / 分化

【研究成果の概要】

本研究は、造血幹細胞によって誘導されるMSC のステムネス・シグナルを解明し、シグナル関連分子を活用して高ステムネスを維持するMSC 増殖培養法を確立することにより再生医療の発展の一助とすることを目的として、これまで造血幹細胞（HSC)とMSCを共培養することによりin vitro環境下における造血-間葉相互作用を再現し、HSCからMSCに流れるシグナルの同定を網羅的遺伝子解析にて行い、選定した遺伝子の機能評価およびMSCのステムネスに寄与することの証明を行っている。また、これらの結果を基に、in vitro培養系を確立し、培養したMSCを動物モデルに移植した時の治癒評価をおこなっている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】18,070千円 (直接経費: 13,900千円、間接経費: 4,170千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】21390365 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝再生 / 肝幹・前駆細胞 / 細胞移植 / 増殖 / 分化 / 肝組織形成 / 肝発生 / 人工肝臓 / 小型肝細胞 / 成熟化 / CD44 / 胆管形成 / 3次元培養 / 肝臓 / 幹・前駆細胞 / 移植 / 組織形成 / 再生医学 / 遺伝子導入 / 組織化 / 細胞相互作用

【研究成果の概要】

肝前駆細胞である小型肝細胞を増産する手法の開発とin vitroにおける肝組織化とその移植方法の確立を目的に研究を行った。小型肝細胞は成熟肝細胞とは異なりFollistatin/Activin系により増殖が制御されていることがわかった。幹細胞であるOval細胞は小型肝細胞を介して肝細胞に分化するが、十分に成熟化することはできず、移植しても長期間生着し続けることはできず細胞老化に陥る。その結果は、肝幹・前駆細胞は一時的に肝機能を補助する細胞としての働きをしていることを示唆する。また、小型肝細胞、星細胞、血管内皮細胞を用いた類洞再構築モデルを確立し、星細胞が血管構築と肝細胞分化を制御していることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】血液内科学

【研究領域課題番号】19591139 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨髄性白血病 / C / EBP / PU.1 / Myc / 分化 / レチノイン酸 / 増殖 / MLL遺伝子 / FLT3-ITD / 骨髄系分化 / 単球系分化 / 急性骨髄性白血病 / プロテオーム解析 / 転写因子 / 融合遺伝子

【研究成果の概要】

LL遺伝子異常を有する急性骨髄性白血病(AML)における、顆粒球系分化に重要な転写因子C/EBPαおよびC/EBPεの意義を明らかにするために、同異常を有する細胞株に遺伝子導入したところ、成熟単球分化が誘導された。この時、単球系分化に重要な転写因子Sfpi-1(PU.1)の発現を伴い、癌遺伝子Mycはこれに拮抗的に作用した。レチノイン酸存在下でも生じる成熟単球分化においても、C/EBPαおよびC/EBPεの発現増加を伴っていた。これらの所見は、MLL遺伝子異常を有するAMLに対する分子療法の基礎的所見として重要であると考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】18659593 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

移植・再生医療 / 軟骨 / 増殖 / 足場素材 / 軟骨再生 / 軟骨細胞 / 三次元培養 / 分化 / 生分解性ポリマー

【研究成果の概要】

口腔・顎顔面の軟骨再生医療を広く普及させるため、吸収性ポリマー製造技術と中空糸製造技術を応用し、3次元増殖培養装置と非侵襲評価装置の機能を有する軟骨再生のための新規足場素材の開発を行った。吸収性ポリマー製中空糸による軟骨細胞増殖培養システムの検討としては、中空糸モジュールを用いた軟骨細胞の3次元培養において増殖状態を評価した。前年度に最適化した0.3%コラーゲンゲルを用いて中空糸モジュールでヒト軟骨細胞を増殖したところ、一回の培養で10倍増以上の良好な細胞増殖と細胞収量を得ることが出来きた。培養中、コラーゲンゲルの収縮がみられたものの、収縮分の体積で補正すると十分な細胞密度を得ることができた。吸収性ポリマー製中空糸の移植用足場素材への応用に関しては、様々な構造を有する吸収性ポリマー製の立体格子型足場素材を製造し、その力学的強度ならびに気孔率を評価した。その結果、ファイバー径1.0mm、開口径2.0mmの立体格子型足場素材がヤング率15MPa、気孔率90%と目標値に近い値を示した。本足場素材とヒト軟骨細胞を用いて再生軟骨を作製し、ヌードマウスに移植したところ、II型コラーゲンやプロテオグリカンの発現・集積が見られる良好な再生軟骨を得た。吸収性ポリマー製中空糸を用いた再生組織非侵襲評価法の開発では、吸収性ポリマーとして代表的な乳酸系ポリマー製の立体格子型足場素材を作製し、X、Y軸方向のファイバーから光源をいれて、Z軸方向のファイバーを受光ファイバーとした光学系を構築し、その光学性能を検討し、原理的な可能性を実証した。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】16390431 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ナノテクノロジー / 再生医療 / 軟骨細胞 / ハイドロゲル / 液性因子 / 三次元培養 / 増殖 / 分化

【研究成果の概要】

軟骨は運動・支持組織の主要な構成組織であり、外傷、加齢性疾患などの様々な疾患により障害をうける軟骨の再生、再建は、整形外科学のみならず現代医学の最重要課題の一つとなっている。軟骨再生医療は徐々に成果を挙げつつあるも、広範に軟骨が欠如している変形性関節症や、顎顔面先天異常などの他科疾患に広く応用するためには、in vitroで、3次元構造を有する再生軟骨を作る必要がある。一方、近年、必要な分子組成あるいは分子構造を人工的に合成し、高機能高分子化合物を創製するナノ分子技術が飛躍的な発展を遂げている。本研究では、ナノ分子技術を応用し、患者由来の軟骨細胞をin vitroで大量増殖させ、3次元形態を有する再生軟骨を作製することを目的として、ナノ分子技術を応用した増殖および分化培養法の確立、ならびに再生軟骨の機能化と性能評価を行った。
培養中に生じる軟骨細胞の脱分化現象を防止するためには3次元培養が有効である。しかし、軟骨細胞の3次元大量培養法は報告例がない。本研究では、ナノファイバーである中空糸を導入し、3次元大量培養装置の開発を試み、その基盤技術を確立した。また、軟骨細胞増殖培養に伴って生じる細胞の脱分化という問題に対処すべく、脱分化型軟骨細胞を再分化させるための液性因子の組み合わせを網羅的に検索したところ、BMP-2とinsulin、甲状腺ホルモン(T3)の組合せ(BIT)が理想的な再分化誘導法であることを見出した。軟骨細胞の増殖・分化に必要な足場素材に関しても、感染の危険性のない新規合成ペプチドの使用を検討した。さらに、遺伝子導入に使用する機能化ナノミセル構造体に関しても、検討を進め、軟骨再生への応用を試みた。いずれも、近年急速に進歩したナノ分子技術の成果をいち早く再生医学に導入し、医工の融合により、実現が望まれている軟骨再生を試み、大きな成果を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】14,400千円 (直接経費: 14,400千円)

【研究分野】神経科学一般

【研究領域課題番号】12308042 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経幹細胞 / 分化 / 増殖 / ニューロン / グリア / FACS / パーキンソン病 / モノクローナル抗体 / ephrin B1 / 放射状グリア細胞 / M6a / 神経発生 / 細胞分化 / gp130 / EGFのレセプター / Gab1 / 欠失変異体マウス / 長期維持機構 / オリゴデンドロサイト前駆細胞 / GFAP / ネスチン / Green Fluorescent Protein(GFP) / 脳室周囲部 / トランスジェニックマウス / セルソーター

【研究成果の概要】

神経幹細胞のマーカーであるnestin遺伝子のエンハンサー領域を用いてgreen fluorescent protein(GFP)を神経幹細胞に強く発現させ、その細胞を可視化し、さらにfluorescence activated cell sorting(FACS)を用いて分離する方法を開発した。同様に、異なる細胞腫に発現する幾つかの遺伝子のプロモーター領域を用いて、ニューロン前駆細胞、およびドーパミンニューロンを可視化・分離することに成功した。分離・濃縮された神経幹細胞あるいはドーパミンニューロンを、パーキンソン病モデルラットへ移植したところ、アンフェタミンによって誘発される回転運動が有意に抑制されることから、脳内でドーパミンニューロンに成熟し機能回復が起こったものと考えられた。さらに、ES細胞にGFPレポーターを導入して、ES細胞から分化誘導したドーパミンニューロンの分離を試みた。FACSで分離した細胞を同様に、パーキンソン病モデルラットヘ移植し、機能回復を確認した。これらの方法は、将来神経変性疾患の治療に必要な細胞の分離の方法を開発する際に役立つものと考えられるが、トランスジーンを導入しなければならないという欠点がある。そこで、神経幹細胞およびそこから分化した細胞の表面に特異的に発現する蛋白質に対するモノクローナル抗体を作成するため、胎仔前脳細胞を免疫して得られたハイブリドーマの大規模なスクリーニングを行った。FACS及び免疫組織化学によって選別されたクローンのうち、特に興味深いものを二つ選択して、発現クローニング法によって抗原遺伝子を決定したところ、EphrinB1とM6であることが明らかになった。これらの蛋白質は、神経幹細胞およびそこから発生する神経系細胞の増殖・分化に関与している可能性がある。また今回得られた抗体はこれらの細胞の分離に役立つ可能性があると考えられる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2003

【配分額】19,890千円 (直接経費: 15,300千円、間接経費: 4,590千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】10770579 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 幹細胞 / 分化 / 増殖 / 自己複製 / 肝細胞 / 胆管細胞 / liver / regeneration / organogenesis / stem cell / cell growth / differentiation

【研究成果の概要】

単離した肝細胞集団の中から、多能性を持つ肝幹細胞をFACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた細胞分離法により濃縮・純化し、それらの機能解析を行うことを目的として研究を行った。まず、in vitro肝幹細胞機能解析系の確立を目的として、マウス胎仔肝細胞の培養系を検討し、1個の細胞を始点とするクローン性コロニーを効率よく誘導可能な培養条件を決定した。そして、このコロニー形成能を指標として、FACSとモノクローナル抗体により画分化したマウス胎仔肝から単離した細胞群の解析を行った。その結果、胎仔肝中の非血球画分であるCD45^-TER119^-細胞から段階的に画分化を進め、最終的にc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞中に限定的、かつ、高頻度に増殖能の高いコロニー形成能を有した細胞が存在することが判明した。さらに、それらのクローン性コロニーを拾い上げRT-PCRおよび免疫染色法による細胞系列マーカーの発現の検討を行った。その結果、肝細胞マーカーと胆管細胞マーカーの発現を共に確認した。すなわち、1個のc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞から肝細胞と胆管細胞という異なる系列の細胞が分化し得ることを明確に証明した。また、FACSにより分離したc-Kit^-CD49f^+CD29^+CD45^-TER119^-細胞は、in vivoにおいても肝組織再構築能を有することを細胞移植により確認した。これらの結果は、マウス胎仔肝臓中のc-Kit^-CD49f^+CD29^+ CD45^-TER119^-細胞は、高い増殖能、多分化能、組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞(hepatic stem cell)であることを示唆する。すなわち、本研究により、精度の高い肝幹細胞の純化・回収法が世界に先駆けて初めて確立された。これらの成果に関する論文は、現在投稿中である。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】発生生物学

【研究領域課題番号】08044189 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞同期 / 細胞分化 / パターン形成 / 増殖 / 分化 / 細胞質分裂 / リン酸化タンパク質 / 細胞内情報伝達 / 細胞性粘菌 / パたーン形成 / 飢餓

【研究成果の概要】

粘菌における細胞機能の分子機構について国際共同研究を実施し、主として以下の点を明らかにした。
1)精度の高い同調培養系、および安定な細胞マーカー遺伝子と細胞型特異的遺伝子を合わせ持つ2重形質転換体を用いることによって、飢餓処理の時点での個々の細胞の細胞周期内位置がその後の発生過程での細胞分化・パターン形成に決定的に重要であることを明らかにした。すなわち、細胞周期上の増殖/分化の分岐点(PS点)の直前で飢餓処理された細胞は予定胞子細胞にのみ分化し、一方、PS点の直後に飢餓処理された細胞は予定柄細胞にしか分化しないこと、また予定胞子細胞の分化にはそれに先だって細胞周期の再開が必要であることが示された。
2)発生開始のシグナルになる飢餓の情報は、細胞内遊離カルシウム・イオン濃度[Ca^<2+>]iの一過性の上昇によって、細胞内に伝達されること、また飢餓認識・応答に関与する可能性のあるリン酸化タンパク質がいくつか見出された。
3)増殖/分化の切り換えに関与する可能性の高い遺伝子が新たに3つ単離・同定され、またこの切り換えに重要な役割を果たすと考えられる101kDaリン酸化タンパク質がタンパク質合成時のアミノ酸伸長に必須の伸長因子-2(elongation factor-2)であることが明らかにされた。
4)細胞質分裂に関して、ヒトIQGAPに相同なGAPタンパク質が細胞質分裂最終段階の中央体切断に働くこと、また37kDaの新奇タンパク質が細胞質分裂に関与することが示された。
5)cAMPへの走化性運動に関しては、酵母の類似体があるAmiAタンパク質とTrfAタンパク質の2つがともに走化性に関わることが明らかにされた。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】4,900千円 (直接経費: 4,900千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07409001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカン / サイトカン受容体 / シグナル伝達 / 造血 / アポトーシス / 分化 / RAS / STAT / サイトカイン / サイトカイン受容体 / 血管内皮 / 発生 / 誘導遺伝子 / 細胞分化 / 造血因子 / JAK / Ras / 幹細胞 / 造血細胞 / 増殖 / 細胞死 / キナーゼ / 細胞増殖

【研究成果の概要】

IL-3/GM-CSF/IL-5受容体の変異体を使ったシグナルの解析からRASとSTAT5という二つの主要なシグナル伝達経路が明らかになってきたので、これらの活性化とサイトカイン機能との関連を中心に研究を展開した。造血細胞はその増殖だけでなく、生存にもサイトカインによる刺激を必要としており、RASの活性化は造血細胞においては細胞死の抑制に重要であることを明らかにした。さらに、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していること、またサイトカイン除去による細胞死にもcaspaseが関与することなどを明かにした。一方、多くのサイトカインはSTAT5を活性化するが、その生理的意義を明らかにするために、STAT5誘導性遺伝子の分離を行い、SH2ドメインをもつ新規シグナル分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatin M(OSM)などを同定した。CISはサイトカインのシグナルをnegativeに制御する分子であることを示した。優勢抑制型のSTAT5変異体を用いた実験から、STAT5が造血細胞の細胞あるいは赤芽球分化に重要な機能をもつことを明らかにした。さらに、STAT5とRASによるシグナル経路がクロストークすることも示した。STAT5誘導遺伝子として同定されたOSMの機能の検索を行い、胎生期での血球発生過程や生殖細胞などに作用があることを示した。また、遺伝子クローニングによりOSM受容体の分子構造も明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1998

【配分額】36,500千円 (直接経費: 36,500千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】04454171 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

転写因子 / Wilms腫瘍 / 癌抑制遺伝子 / WT1 / 細胞周期 / 分化 / cyclin / CDK / 白血病 / Zinc finger / 増殖 / zinc finger / splicing / WT遺伝子 / WT蛋白質

【研究成果の概要】

Wilms腫瘍の癌抑制遺伝子産物WT1が細胞の増殖、分化に果たす役割を明らかにすることを目的として研究を進め以下の結果を得た。
1.WT1蛋白質による細胞周期制御機構の解析
WT1cDNAをNIH3T3細胞に微量注入して過剰発現させる実験により、WT1がG1期に作用して細胞周期のS期への進行を抑制する機能をもつことを明らかにした。さらにCDK2/cyclin EあるいはCDK4/cyclin D1をWT1と同時に過剰発現するとWT1の効果が阻害されることを見いだした。また、WT1を過剰発現している細胞では、血清によるCDK2、CDK4、cyclin D1の発現誘導はおこるが、CDK2およびCDK4の活性亢進はおこらなかった。これらの結果から、WT1による細胞周期の制御機構にはCDK/cyclinの機能制御が重要であると考えられた。
2.WT1蛋白質による細胞分化制御機構の解析
WT1は白血病細胞やEC細胞の分化にともなって発現が低下すること、WT1を恒常的に発現させるとEC細胞がapoptosisをおこすことを見出した。したがって、WT1の発現低下は正常な分化に必須の現象であると考えられた。また、急性白血病ではWT1が異常発現しており予後と相関があること、WT1のPCRによる定量が残存白血病の検出に有用であることが明かとなった。
3.WT1結合蛋白質の同定
酵母を用いたtwo-hybrid systemを用いてWT1結合蛋白質をコードする可能性のあるcDNAを単離し、遺伝子産物がin vitroでWT1と結合することをみいだした。今後in vivoでのWT1結合能および機能の解析を進めて行く予定である。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1992 - 1994

【配分額】6,100千円 (直接経費: 6,100千円)

【研究分野】化学系薬学

【研究領域課題番号】62430026 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分化 / 増殖 / ビタミンA / レチノイド / レチノイン酸 / テレオシジン / フォルボ-ル / 活性ビタミンD_3 / 活性ビタミンD3 / ビタミンA酸 / レセプター / 構造活性相関 / 核内レセプター / 分化誘導物質 / 血球分化 / 芳香族アミド / アフィディコリン / サイトカイニン / ペプチド / cーcmyc

【研究成果の概要】

細胞の増殖と分化という最も生命にとって基本的な現象を調節する低分子の有機化合物の化学的研究を進めた。
最も重点を置き、また進歩があった成果は、レチノイドに代表される細胞分化調節分子の構造活性相関の研究である。ビタミンAの誘導体であるレチノイン酸に代表されるレチノイドの構造を大きく変化させ、構造的にヴァライエティに富む、そして、物性にも特徴のある化合物を合成した。そしてそれらの立体構造をnmrおよびX線結晶解析によって明らかにした。新しいタイプの化合物としては、構造活性相関の研究に基づいて、トリメチルケイ素やトリメチルゲルマニウム基をもつ化合物を合成し作用を評価した。
細胞分化においてフォルボ-ルエステルは強力であり、また、それとは構造の異なるテレオシジンも強力かつ特異的である。これらの構造的対応関係を各種合成化合物の活性と計算機を用いるレセプタ-マッピングによって明らかにした。この結果から新しい発ガンプロモ-タ-やその阻害剤が合成可能である。
この研究はさらにフォルボ-ルエステルのレセプタ-探索へと進行した。ヒト細胞(HeIa および HL-60)にフォルボ-ル特異的結合タンパクの存在をみとめた。このタンパクは細胞質に存在し、フォルボ-ルが存在すると核へ移行する。またテレオシジンはフォルボ-ルの結合と競合する。さらに、非TPA型発ガンプロモ-タ-といわれていたタプシガルギンも競合的であり、このタンパクこそ、発ガンプロモ-ションに関与するレセプタ-タンパクであると考えられる。
ビタミンD活性体の合成研究、核酸の認識物質、酵素類似機能物質の研究成果をえた。植物の細胞分裂誘起物質のレセプタ-探索のためのプロ-ブを合成した。

【研究種目】一般研究(A)

【研究期間】1987 - 1989

【配分額】30,700千円 (直接経費: 30,700千円)