【研究領域課題番号】20H03826 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮 / 幹細胞 / ゲノム編集 / 再生医学 / 光制御

【研究成果の概要】

令和3年度は，これまでわれわれが行ってきた部分的な子宮の再生・再建の技術と基盤知見をもとに，ラットを用いて子宮機能の中心的な役割を担う子宮内膜の全層再建・再生技術の開発を行った．その結果，脱細胞化子宮内膜骨格 (Decellularized Endometrial Scaffolds, DES)を用いることで，より効率的に子宮内膜の全層再生が促されることが判明した．さらに光遺伝操作と再細胞化（再生）に適した細胞の候補として，様々な子宮内膜由来細胞（正常・不死化・癌細胞）とその幹細胞について検討を行ったところ，ある内膜癌幹細胞株が安定期に幹細胞特性を有することが明らかになり，その幹細胞特性や再生医療への応用について検討した．また子宮全体の再生および子宮疾患の代表である子宮筋腫の病因メカニズムの解明の観点から，ヒト子宮平滑筋細胞に光応答性ゲノム編集ではなく通常のゲノム編集による遺伝操作を加えて増生能力の増強や造腫瘍能の獲得の有無などを検討したところ，一部に変化は見られたが予想していた特性は付与されず，その原因として用いた細胞が平滑筋幹細胞では無かったことが考えられた．また，光応答生ゲノム編集技術の改善・改良と新しい研究ツールや治療法としての妥当性を検証するべく， 着床に関連する挙動を示すものの機能不明の新しい分子を光応答性ゲノム編集の標的分子として基礎的解析も行った．異所性に子宮内膜様病変を作成して子宮内モデルを構築する際に，内膜症候補細胞を搭載したDESや磁性体などを用いて細胞を集積するなどの技術が必要となるが，その技術開発も行った．

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】17H06642 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医療 / 毛髪再生 / 毛包新生 / 細胞移植 / 幹細胞 / 毛乳頭細胞 / 毛根鞘細胞 / 低酸素 / 再生医学 / 毛包再生 / 毛包幹細胞

【研究成果の概要】

脱毛症に対する先進医療として、細胞を用いた毛髪再生医療が注目されている。毛包由来の毛乳頭細胞を用いた基礎研究が多く行われる中、未だにヒト細胞から構成される毛包の新生は実現していない。近年、毛包を構成する真皮毛根鞘に比較的未分化な細胞が多く存在することが明らかになってきた。この真皮毛根鞘に存在する間葉系細胞である真皮毛根鞘細胞に着目し、臨床応用可能な毛髪再生治療を開発することが本研究の目的である。本年度は、まず臨床検体の採取と毛包由来の毛乳頭細胞および真皮毛根鞘細胞の初代培養を行った。患者からの提供検体に付属する毛包を採取し、毛乳頭と毛根鞘をそれぞれ単離した。大気酸素下または低酸素下で細胞培養を行ったところ、いずれの場合も細胞の増幅が可能であったが、特に真皮毛根鞘細胞は低酸素環境下で増殖活性が増大した。細胞移植による治療には細胞の増幅が不可欠であるが、毛乳頭細胞よりも増殖活性の低い真皮毛根鞘細胞の増幅を得るためには低酸素環境下での培養が有効であることを確認できた。次に増幅後の培養細胞を用いて遺伝子発現解析を行った。細胞内に発現している多分化能関連遺伝子のmRNA量をRT-PCRで解析したところ、真皮毛根鞘細胞ではSOX2の発現が毛乳頭細胞と比較して40倍以上高値を示した。真皮毛根鞘細胞は毛包再構築の主体となる毛乳頭細胞とは異なる特徴をもつこと、および毛包新生を実現するための移植細胞ツールとして高い潜在性を有することが確認できた。

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2017-08-25 - 2019-03-31

【配分額】2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)

【研究分野】小児外科学

【研究領域課題番号】16H02682 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 再生医療 / 腸管蠕動不全 / 移植・再生医療 / 再生医学 / 細胞・組織 / 歯学 / 小児外科学 / 再生医療学 / 乳歯幹細胞学 / 細胞移植 / 組織工学 / 指定難病 / ヒルシュスプルング病 / ヒルシュスプルング病類縁疾患 / 乳歯幹細胞

【研究成果の概要】

上記疾患群の中で予後不良である腸管神経節細胞僅少症(HYPO)に、第一にfocusをした。HYPOは腸管神経節細胞は存在するがその数が極めて少ない特徴を有す。同じく腸管神経細胞の減少を認めるマウス(JF1)を用いて、健常児由来の乳歯幹細胞(SHED)を投与した。結果、体重増加を得、その有効性を証明した。次に、HYPO患者由来のSHED(HYPO-SHED)の解析を行った。SHEDは間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)であるが、HYPO-SHEDは、MSCに矛盾しない表現型を有していること、ならびに増殖能や造腫瘍性に関する解析を行った。

【研究の社会的意義】

SHEDはiPS細胞と比較し遺伝子導入が不要、作成効率が概ね100%、高い自己再生能、HLAの発現が低く拒絶を受けない点で優れ、さらに低侵襲かつ容易に採取可能である。また、歯髄の状態で凍結保存が可能であるため乳歯幹細胞のバンクをつくることができる。本基盤研究にて、健常児由来SHEDにおけるhypoに対する治療メカニズム・治療効果を詳細に解明した上で、hypo-SHEDの細胞の特性の解析に移行し、自家細胞移植の可能性を模索し、バンク化も目指す乳歯保存の基盤づくりを行った。このように実臨床における治療を視野に自家他家移植いずれも実現することを目標とできた本研究は大きな学術的、社会的意義を有する。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2016-04-01 - 2020-03-31

【配分額】47,450千円 (直接経費: 36,500千円、間接経費: 10,950千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】15H05044 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨再生 / 間葉系幹細胞 / 同種細胞移植 / 遺伝子 / 生体材料 / 骨芽細胞分化 / 再生医学 / 臍帯 / 幹細胞 / 骨分化 / リプログラム / 遺伝子活性化基質

【研究成果の概要】

本研究の目的は、in vivo Direct Conversionを誘導する遺伝子活性化基質によって、生体内で臍帯由来MSCを骨芽細胞へ直接分化させることで、簡便で確実な骨組織の再生法を開発することにある。 即ち、培養により大量に増殖させた臍帯MSCと、骨芽細胞分化を誘導する遺伝子群を組み込んだ基質を一体化して骨欠損部へ移植することで、顎骨の再生を図る。本研究期間中の成果としては、細胞骨格因子であるアクチンの脱重合に関わる遺伝子群とBMPシグナルの制御に関わるmiRNA群をGAMに応用し、それを臍帯MSCの担体とすることで骨再生を促す技術の可能性について一定の知見を得ることができた。

【研究の社会的意義】

本研究の独創的な点は、臍帯MSCの利点を最大限に活用するin vivo Direct Conversionの手法によって、骨芽細胞分化と血管網構築の両面から効果的に骨再生を成し遂げようとするところである。本研究の研究分担者らは、様々な希少・難治疾患に対する臍帯MSCの応用研究を実施しており、そのための系統的資源化を推し進めている。同種移植可能で、安定供給が可能である細胞による効果的な骨再生法を開発できれば、革新的な細胞治療法が実現する。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)

【研究分野】生理学一般

【研究領域課題番号】25221303 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 細胞周期 / p57 / 再生医科学 / 再生医学

【研究成果の概要】

われわれは１）低増殖、２）低代謝、３）低酸化の三条件が組織幹細胞の一般的な通則であることを仮定し、全身の組織幹細胞におけるp57、Fbw7、Fbxl5の重要性を明らかにすることを本研究の目的とした。研究の過程でCDK阻害分子p57の発現が最も幹細胞特異的であることを発見したため、p57陽性細胞系統追跡マウスを解析したところ、造血幹細胞や神経幹細胞、腸管幹細胞で特異的な発現パターンを確認した。さらに遺伝子破壊実験や系統追跡実験を行い、p57の細胞周期停止作用や幹細胞性に対する影響を見積もり、その生物学的重要性を確認した。さらにがん幹細胞においてもp57は必須であることを実証した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2013-05-31 - 2018-03-31

【配分額】216,450千円 (直接経費: 166,500千円、間接経費: 49,950千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】25670846 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 骨代謝学 / 細胞周期 / 細胞分化 / 幹細胞 / 骨形成 / 骨吸収 / 骨軟骨分化 / 骨再生

【研究成果の概要】

本研究では、細胞周期制御との関連が強いRunx2と同じruntファミリーに属するRunx1とRunx3が間葉系細胞の骨分化能促進機能を有すること、ならびに、高分化能を有する間葉系細胞において古典的Wnt経路の抑制によってサイクリンD1発現が抑制されており、サイクリンD1が骨軟骨分化の振り分け機能を有すること、を明らかとした。さらに細胞周期制御において重要な機能を果たしていると想定された分子の中から、破骨細胞分化の際に発現が上昇する一方で骨芽細胞分化の際に発現が低下する分子、逆に破骨細胞分化の際に発現が低下する一方で骨芽細胞分化の際に発現が上昇するという発現変動パターンを示す分子を複数同定した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】24500447 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Musashi1 / RNA結合タンパク質 / 神経発生 / 神経回路 / 未分化維持 / 翻訳制御 / 転写後制御 / 神経分化 / Musashi / Dcc / Dcx / 分化 / 幹細胞 / 再生医学

【研究成果の概要】

Msi1は神経前駆細胞で高発現するRNA結合蛋白質であり、神経分化を司る。主な分子的機能は、標的mRNAの翻訳制御である。
その標的探索の為に、マウス胎仔由来のmRNAからin vitro SELEX法による探索を行ったところ、dcc遺伝子の3'UTR領域が検出された。Dccは神経の成長円錐に存在する膜受容体であり、Netrrin1シグナルを受容し軸索や細胞を誘引する。
本計画で行われた解析により、dccがMsi1の特異的標的であり、既知の機構により翻訳抑制されることを明らかにできた。現在はこの分子機構と神経発生の関係性について、Msi1 KOマウスを用いた解析を進めている。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】23249076 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 子宮内膜 / 子宮平滑筋 / 子宮内膜症 / 子宮筋腫 / 再生医学 / 脱細胞化 / 子宮 / 疾患モデル

【研究成果の概要】

本研究では、子宮における幹細胞に対して時空間的な介入を行うことで子宮の正常と異常（疾患）の再構成とその技術開発を目指した。まず子宮内膜の再構成系と細胞追跡法による新しいin vivo子宮内膜幹細胞アッセイを開発した。これにより内膜幹細胞の最有力候補とされた内膜side population(SP)細胞が、子宮内膜症の発生においても重要な役割を担う可能性が示された。また子宮平滑筋腫の発生・進展に子宮筋腫SP細胞とWNT/β-Catenin経路が関与することを明らかにした。ラット子宮の脱細胞化・細胞化技術を開発し、子宮の構造と機能をin vitro 及びin vivoで再構成することを可能にした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2011-04-01 - 2014-03-31

【配分額】50,050千円 (直接経費: 38,500千円、間接経費: 11,550千円)

【研究分野】胸部外科学

【研究領域課題番号】23592047 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 間葉系 / 細胞移植 / 低侵襲 / 内視鏡 / 心不全 / 移植・再生医療 / 再生医学 / 循環器・高血圧 / 重症心不全 / ヒト幹細胞

【研究成果の概要】

全身麻酔下のビーグル犬を用いて、セルディンガー法により心嚢内に内視鏡を挿入して心嚢内の視野を確保した。心嚢内での内視鏡手術手技の確立、周辺機器の最適化、心外膜側からの細胞移植デバイスツールの開発をすすめた。ビーグル犬の左室にヒト胎盤由来間葉系細胞の左室20カ所への移植を行い、手技中の血行動態の変化をモニタリングした。さらにペースメーカーワイヤの留置にも成功した。
また、PPAR-γおよびARBを中心に、数種類の候補分子について幹細胞の生着率、心筋分化誘導率の変化などについて検討した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】20249067 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 移植・再生医療 / 応用動物 / 細胞・組織 / マイクロアレイ / 幹細胞

【研究成果の概要】

ヒト雌性生殖器官における幹細胞の生理的・病理的意義と役割を明らかにするとともに、幹細胞を標的にした疾患制御法の開発を目指すことが本研究の目的である。研究成果としては、子宮筋の幹細胞を分離・同定するための新しい方法を開発するとともに、妊娠子宮のリモデリングに子宮筋幹細胞が重要な役割を果たすことを明らかにした。一方、子宮内膜の幹細胞の分離・同定とその解析を通じて、内膜幹細胞が子宮内膜の再生に加えて子宮内膜疾患のひとつである子宮内膜症の発生に関与する証左を提示し得た。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】50,180千円 (直接経費: 38,600千円、間接経費: 11,580千円)

【研究分野】解剖学一般(含組織学・発生学)

【研究領域課題番号】20590196 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞・組織 / 再生医学 / 脳・神経 / 発生・分化 / 神経科学 / 中枢神経系 / 幹細胞 / 遺伝子 / 細胞死

【研究成果の概要】

我々が既に単離同定している神経幹細胞に発現する新規遺伝子群のなかかのひとつSE90/radmis遺伝子について解析を進めた。in situ hybridization解析により、radmis mRNA発現は胎生期の脳室周囲層、および生後や成体脳の側脳室の脳室下層といった神経幹細胞が局在すると考えられる部位での発現が認められた。また特異的抗体による組織学的解析の結果、radmisタンパクは神経幹細胞の放射状細胞突起と分裂期紡錘体微小管に一過性に局在し、分裂後は速やかに後期促進複合体APC/Cdh1によるユビキチン化を受けてタンパクが分解され、幹細胞内から除去される可能性が示された。実際の個体レベルでの神経発生過程でのradmis遺伝子の機能を検討するため、ユビキチン化を受けないよう改変した変異型radmis遺伝子を作製し、子宮内電気穿孔法によりマウス胎児の脳室内へ遺伝子導入を行った。その結果、radmis遺伝子を強制発現した神経幹細胞では分裂の亢進と細胞移動の異常が起きる事が明らかとなった。以上のデータからradmisが神経幹細胞の分裂制御に重要な働きを持つことが示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】19659467 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

毛包 / 幹細胞 / 膜表面マーカー / 細胞集塊 / 再生医学

【研究成果の概要】

本研究はマウス真皮に幹細胞が存在すること示し、真皮幹細胞の指標となる膜表面マーカーを調べ、分離培養することを目的とした。
研究代表者らは、これまでの毛の幹細胞に関する研究から真皮の中にも、細胞分裂をほとんどしない、いわゆるlabel retaining cellを発見した。これは、種々の幹細胞の発見から推定される本来の意味の幹細胞と考えられる。また、side populationやskpの中にも幹細胞が含まれると予想されている。われわれは、この3者が共通の性質を持つか否かを検討した。
平成20年度は、真皮幹細胞の同定のための膜表面マーカーの解析を中心に行った。
Label retaining cellとしてskpを形成した細胞の一部にlabel retaining cellを形成している細胞が存在した。培養を開始すると、skpの分裂速度は減少し、このためBrdUの発現を認める細胞が培養初期は確認できた。skpと同じ条件で培養した真皮細胞で、細胞集塊を作らず接着している細胞の発現遺伝子を同様に比較し、発現遺伝子の膜表面マーカーを調べた。skpでコントロールの細胞に比して優位に発現が上昇している遺伝子が、真皮幹細胞で発現している遺伝子である可能性が高いので、label retaining cellとの共発現の有無を検討した。label retaining cellで、幹細胞のマーカーと共発現する細胞が認められた。一方でskpは培養初期には同様のマーカーを発現するものの、培養とともに減弱した。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】皮膚科学

【研究領域課題番号】18390315 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

皮膚生理学 / 再生医学 / 毛嚢 / 皮膚幹細胞 / バルジ / 毛乳頭 / 組織再構成 / 幹細胞

【研究成果の概要】

CD200と呼ばれる細胞表面のタンパクを目印に、ヒトの毛嚢のもととなる幹細胞を多く含んだケラチノサイト(皮膚の細胞)をヒト頭皮から分離・培養した。また、毛嚢を形作るシグナルを送る能力(毛誘導能)を維持したままヒト毛乳頭細胞を培養する技術を開発した。得られたCD200陽性の毛嚢細胞(バルジ細胞)と毛誘導能を有する毛乳頭細胞を組合せて免疫不全マウスの体内に移植し、ヒト毛嚢に類似した構造体を得ることができた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】18,130千円 (直接経費: 15,400千円、間接経費: 2,730千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】18592166 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨・軟骨 / 再生医学 / 幹細胞 / 骨軟骨 / 再生医療 / Nanog遺伝子 / 分化

【研究成果の概要】

組織再生医学を口腔外科臨床に応用するため、胎性幹細胞(ES細胞)の分化多能性維持に必須の因子であるNanog遺伝子を間葉系細胞に導入し、自己複製を促進させ、分化形質を向上させることを試みた。本研究の目的は、間葉系幹細胞の分化性能を向上させるため、Nanog遺伝子を、間葉系細胞へ導入し、効率的な骨・軟骨形成を図ることである。まず、株化培養細胞へのNanog遺伝子導入と機能解析を行った。マウス株化細胞C3H10T1/2、MC3T3-E1、ATDC5におけるNanog遺伝喚およびタンパクの発現レベルの変化をPCRならびにWestern blottingで解析したところ、これらの綱胞においては、遺伝子レベルあるいはタンパクレベルでのNanogの発現はほとんど検出できなかった。ついで、上記細胞にvirus vectorを用いてNanog cDNAを一過性にあるいは恒常的に遺伝子導入した際の細胞分化に与える効果を検討したところ、Nanogは骨分化を制御する機能を有することを示唆する結果が得られた。さらに、Nanog RNAiを用いた発現抑制実験として、同細胞にNanog RNAi virus vectorを導入し、細胞分化、増殖に与える効果を確認するとともに、クローン化細胞の作製を行い、Nanog抑制効果を検討した。さらに、Nanog恒常発現による骨分化能促進メカニズムを解析した。まず代表的な骨分化シグナルであるBMPシグナルの下流分子であるSmad1,5,8のリン酸化をウエスタンブロットで比較検討したところ、Nanog導入群ではSmad1,5,8のリン酸化が長時間継続していた。ついで、ES細胞の自己複製に重要なSTAT3のリン酸化を同様にウエスタンブロットで比較検討すると、Nanog導入群ではSTAT3のリン酸化が弱い傾向が認められた。以上により、NanogがES細胞だけではなく、骨・軟骨分化制御機構においても重要な機能を有する可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,020千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 420千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】17209053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / 子宮筋 / 幹細胞 / 動物モデル / 再生医学 / 子宮内膜症 / 免疫不全マウス / 再生

【研究成果の概要】

本研究では、子宮内膜、子宮平滑筋といった雌性生殖器官における成体幹細胞システムの基礎的解明とともに、臓器再生と疾患モデル構築の技術開発という応用面に重点を置いて、以下の3点について研究を進めた。以下がその成果の概要である。
A.雌性生殖器官組織における幹細胞の分離・同定および幹細胞特性の解明
Side population(SP)法を用いて、子宮内膜と子宮平滑筋からSP細胞を純化・精製する方法を確立し、それぞれが未分化状態にあることに加えて、自己増殖能や多分化能といった幹細胞様特性を有することを明らかにした。
B.雌性生殖器官幹細胞を用いた臓器構築とその再生医療への応用
ヒト子宮筋より分離したSP細胞は、重度免疫不全マウス子宮においてヒト子宮筋を構築する能力を有することを示した。さらに、同マウスの腎被膜下に少数のヒト内膜分散細胞を移植することにより、ユニークな血管新生を伴い、且つホルモン反応性変化を呈する内膜組織が再構築されることを示した。さらに、その再構築内膜の振る舞いを、蛍光・発光蛋白マーカーを用いて、非侵襲的リアルタイムに観察可能なシステムを構築し、内膜再生モデルとしての有用性を示した。
C.雌性生殖器官幹細胞を用いた疾患モデルの構築
上記のヒト内膜再生モデルマウスは、内膜症モデルマウスとしてのポテンシャルを有しており、内膜症の発症・進展メカニズムの解明や内膜症治療薬の開発において有用な研究ツールになる可能性を示した。
内膜細胞あるいはその幹細胞から胚受容能を有するヒト内膜組織を再構築しin vitro着床システムの確立を目指しているが、その実験ツールとして、ヒト絨毛細胞株スフェロイド(胚に相当)と内膜腺上皮株を用いたin vitro着床モデルを確立した。また、着床に必須の内膜分化を担う分子メカニズムを明らかにし、それを標的にした着床制御に必要な基盤データも得た。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】49,920千円 (直接経費: 38,400千円、間接経費: 11,520千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】15390452 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

胚性幹(ES)細胞 / 骨分化 / 軟骨分化 / 分化十分条件 / 培養方法 / 再生医学 / 骨 / 軟骨 / 再生 / 胚性幹細胞 / 分化誘導 / 幹細胞 / 胚性幹細胞(ES)

【研究成果の概要】

ラットI型コラーゲン遺伝子プロモーター下流にGFPを付けたトランスジーンを発現するマウス、マウスII型コラーゲン遺伝子プロモーター下流にGFPを付けたトランスジーンを発現するマウスを、それぞれ野生型のマウスと交配させて胚盤胞を分離し、そこからES細胞を樹立した。また、上記トランスジーンを発現するレトロウイルスを作成し、これを野生型ES細胞に感染させて株を樹立した。これらのES細胞は、骨芽および軟骨細胞に分化したときにのみ蛍光を発するので、分化誘導因子のスクリーニングに細胞センサーとして利用した。骨芽分化誘導因子としては、BMP受容体、Hhのシグナル伝達分子であるSmo、Wntの転写因子であるLEF-1、Runx2の発現アデノウイルスを作成し、上記ES細胞センサーに網羅的に組み合わせて加え、Runx2とBMPシグナルの組み合わせが相乗的に強力に骨芽細胞分化を誘導することを見出した。軟骨分化誘導因子としては、BMPおよびSoxシグナル伝達系をES細胞センサーに加え、Sox9と、Sox5あるいはSox6の組み合わせが強力に軟骨分化を誘導することを見出した。これらの実験により、骨芽あるいは軟骨細胞分化誘導のシグナルの最適化を行った。
また、樹立したES細胞を、最適条件で分化させることなく、平面培養で増殖させるための至適条件(継代のタイミングと、コロニーサイズ)を決定した。さらに将来ヒトES細胞を使うことを睨んで、カニクイザルのES細胞を購入し、これを用いて培養・分化方法について経験を積んだ。
上記のごとく決定した至適条件で分化した骨芽様細胞および軟骨様細胞を、それぞれアテロコラーゲンフィルム上に播種して培養し、十分な基質をつくらせ、基質の石灰化及び、トルイジンブルー染色でのメタクロマジーを確認した。このシートを骨・軟骨欠損モデルマウスの欠損部に移植し、移植後1〜4ヵ月後に麻酔後屠殺し、移植部分を組織学的、免疫組織学的に観察したところ、骨欠損のマウスにおいては、良好な再生誘導が見られたが、軟骨欠損に関しては、有意な治癒効果が見られなかった。この原因としては、軟骨分化誘導刺激がまだ十分に最適化されていない可能性が考えられ、今後他のシグナル経路との組み合わせを考慮してスクリーニングしていく予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2005

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】14207066 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / 子宮平滑筋 / 幹細胞 / 分化 / 再生医学 / 子宮筋 / 免疫不全マウス / DNAマイクロアレイ

【研究成果の概要】

本研究では、雌性生殖器官が有する様々な機能メカニズムを明らかにするために、その成体幹細胞の同定・分離・培養技術の確立を通じて、幹細胞システムの解明と再生医学への応用を目的とした。
1.雌性生殖器官における組織幹細胞の分離・同定および幹細胞特性の解明
a)子宮内膜の組織幹細胞
内膜はその高い再生能力から組織幹細胞の存在が強く示唆される。近年、組織幹細胞をside population細胞として分離する方法が開発された。月経周期を通して内膜にはSP(endometrial SP ; ESP)が存在し、免疫不全マウスへの移植実験では、ESP移植部位に腺管構造を有する内膜様組織が再構築され、加えて内膜組織の各コンポーネントより成る様々な組織も構築された。
b)子宮筋の組織幹細胞
子宮筋は妊娠・分娩時に著明な増大と細胞数の増加を示し、産褥期には急激にアポトーシスを起こす。そこで子宮平滑筋における組織幹細胞の同定と単離を目的として、ESP単離と同様の戦略に基づいて、ヒト正常子宮筋層から子宮筋SP(myometrial SP : MSP)を分離した。MSPは細胞周期上quiescentであり、in vitroで骨・脂肪細胞へ分化するとともに、in vivoでは平滑筋様の組織を構築した。
さらに、GeneChip解析によりESPやMSPの発現遺伝子群のなかにABCG2といった幹細胞マーカーが含まれていた。以上より、ESPやMSPが幹細胞的特性を有し、これらを中心とする幹細胞システムが雌性生殖器官に存在する可能性が示された。
2.内膜分化制御
分子標的という観点からヒストンアセチル化およびチロシンリン酸化経路を修飾する低分子化合物を用いたところ、短期間でかつ効率よく子宮内膜の分化を誘導し得た。内膜幹細胞の分化あるいは他の細胞系譜への細胞転換を行う上での基盤データが得られた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】41,860千円 (直接経費: 32,200千円、間接経費: 9,660千円)

【研究分野】血液内科学

【研究領域課題番号】14657241 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

造血幹細胞 / 可塑性 / ヒトES細胞 / 血球細胞 / Tie2 / GFP / 再生医療 / 幹細胞 / 再生医学 / Notch / paraaortic-splanchnopleura(P-SP)領域 / 血管内皮細胞

【研究成果の概要】

GFPトランスジェニックマウス造血幹細胞分画を移植して、脳内からGFP陽性細胞を採取し、神経特異的マーカーであるNeuNやTrk-Rの発現を解析した。この実験では、脳内においてGFP陽性細胞を同定することができ、これらの細胞におけるNeuNおよびTrk-Rの発現を確認した。しかしながら、その発現時期を明確にすることはできなかったため、これらの分子の発現を誘導する転写因子の道程には至らず、したがって遺伝子発現プロファイルを解析し、幹細胞可塑性の分子メカニズムを解明するという当初の目標に到達することはできなかった。
しかし一方申請者らは、科学技術・学術審議会「特定胚及びヒトES細胞研究専門委員会」において、ヒトES細胞の研究計画について審議を受け、平成14年12月に文部科学大臣からの計画承認を受けた。その後、ヒトES細胞の培養に着手し、造血細胞をよりよく分化誘導する条件を検索している。現在までのところ、無血清条件で未分化状態を保ちながらヒトES細胞を維持できているが、血球細胞への分化については血清添加条件でのみ成功している。これと同時に、マウスES細胞を用いて、ES細胞から造血幹細胞への分化を決定する分子を、発現クローニング法により同定を試みている。すなわち、ES細胞にTie2プロモーターでドライブされるGFP発現ベクターを導入し、GFP陽性をESから造血幹細胞への分化方向中胚葉マーカーとして用いる。マウスAGM由来cDNA発現ライブラリーをOP-9ストローマ細胞に導入し、ES由来GFP発現細胞の出現を指標として、cDNAを単離することを試みる。このようにして、別な角度から再生医療への道筋を見いだしたいと考えている。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】13877110 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

臍胎血 / 心筋細胞 / 分化誘導 / 血管内皮細胞 / 再生医学 / 多能性幹細胞 / 心不全 / 細胞移植 / 発生分化 / 幹細胞 / 臍帯血

【研究成果の概要】

【目的】臍帯血より心筋分化能を有する可能性のある細胞を単離し、増殖し、分化誘導を試みた。【方法】(1)臍帯血よりauto MACSを用いて、CD45陰性、CD29陽性、CD34陰性、CD44陽性の細胞群を単離し、ファイブロネクチン塗布培養皿上に接着させた。(2)この細胞を培養し、細胞の増殖曲線を作成した。(3)この細胞の表面抗原をFACS解析した。(4)この細胞をインスリン存在下で培養し、脂肪細胞への分化を観察した。(5)この細胞を0.1mMデキサメサゾン、0.05mMアスコルビン酸-2リン酸、10mMβ-グリセロフォスフィト存在下で培養し、骨芽細胞への分化を観察した。【結果】(1)臍帯血より上記表面抗原の抗体を利用することにより、付着系の間葉系幹細胞が回収できた。この細胞はin vitroである程度増殖させることが可能であった。(2)増殖曲線は一週間で3倍程度の増加速度であった。(3)インスリン存在下ではこの細胞は脂肪細胞に分化した。(4)デキサメサゾン、アスコルビン酸-2リン酸、β-グリセロフォスフィト存在下ではこの細胞は骨芽細胞に分化した。フォンコッサ染色陽性の細胞が観察された。【結論】臍帯血細胞中には間葉系の幹細胞が存在した。この細胞が心筋細胞に分化するかはさらなる研究が必要と考えられた。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】13470151 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

心筋細胞 / 骨髄間葉系幹細胞 / 分化誘導 / 再生医学 / 幹細胞 / CD抗原 / 細胞移植 / 骨髄 / 表面抗原 / FACS / 多分化能 / 多能性幹細胞 / 心不全 / 発生分化 / 間葉系幹細胞 / 細胞増殖因子 / サイトカイン

【研究成果の概要】

【目的】骨髄血より心筋分化能を有する可能性のある細胞を単離し、増殖し、分化誘導を試みた。
【方法】(1)骨髄血よりauto MACSを用いて、CD45陰性、CD29陽性、CD34陰性、CD44陽性の細胞群を単離し、ファイブロネクチン塗布培養皿上に接着させた。(2)この細胞を培養し、細胞の増殖曲線を作成した。(3)この細胞の表面抗原をFACS解析した。(4)この細胞をインスリン存在下で培養し、脂肪細胞への分化を観察した。(5)この細胞を0.1mMデキサメサゾン、0.05mMアスコルビン酸-2リン酸、10mMβ-グリセロフォスフィト存在下で培養し、骨芽細胞への分化を観察した。(5)この細胞を既知の種々の増殖因子で刺激し、心筋分作を観察した。
【結果】(1)骨髄血より上記表面抗原の抗体を利用することにより、付着系の間葉系幹細胞が回収できた。この細胞は,in vitroである程度増殖させることが可能であった。(2)CD29陽性、CD45陰性、CD44陽性、CD34陰性、CD13陰性、CD49e陽性であった。(3)インスリン存在下ではこの細胞は脂肪細胞に分化した。(4)デキサメサゾン、アスコルビン酸-2リン酸、β-グリセロフォスフィト存在下ではこの細胞は骨芽細胞に分化した。フォンコッサ染色陽性の細胞が観察された。(5)この細胞はIGF-1,FGF, TGFb, LIF, EGF, PDGF,エンドセリンでは心筋分化の誘導活性は無かった。しかし、Wntにより心筋特異的転写因子の一部が誘導された。
【結論】骨髄血細胞中の間葉系幹細胞はある種の増殖因子により心筋分化が誘導されると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】16,400千円 (直接経費: 16,400千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】12307016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 骨髄 / 心筋細胞 / 再生 / 心不全 / 細胞分化 / 細胞移植 / 再生医学 / 骨髄細胞 / 発生

【研究成果の概要】

本研究では骨髄間質細胞を分化誘導することにより心筋細胞を作製し、心不全治療に応用しうるレベルに至るまでの基礎研究を行った。今回の一連の研究を通して、(1)骨髄中の多分化成体幹細胞を用いることにより心筋細胞が分化誘導できること、(2)この現象はマウスのみでなく、ヒトの骨髄成体幹細胞を用いても再現できること、(3)骨髄由来の心筋細胞は胎児期心室筋の表現型を取ること、(4)分化当初は洞結節型の活動電位を呈するが、分化とともに心室筋型の活動電位を呈すること、(5)交感神経α1受容体を発現し、心肥大作用を伝達すること、(6)交感神経神経β受容体を発現し、陽性変時作用、陽性変力作用を伝えること、(7)副交感神経ムスカリンM2受容体を発現すること、(8)蛍光色素GFPと心筋特異的プロモーターを使用することにより、心筋細胞のみを単離出来ること、(9)単離した再生心筋細胞を心臓内に移植すると、心臓内で長期間生着出来ること、(10)このような幹細胞は心筋梗塞などの心筋の壊死炎症がある状況では拘束部位に移動し、心筋やほかの細胞に分化する能力を持つこと、(11)ある種のサイトカインは骨髄から幹細胞の移動に積極的に働くこと、(12)幹細胞と心筋細胞の共培養は幹細胞の心筋分化を誘導する可能性のあること、(13)心筋分化能のある骨髄成体幹細胞の表面抗原はヒトとマウスで異なること、(14)ヒトの骨髄成体幹細胞はin vitroで長期間培養するとテロメアの長さの関係で細胞増殖できなくなるが、いくつかの遺伝子導入を行うことにより、細胞増殖できるようになることなどが明らかとなった。このことは骨髄成体幹細胞から分化誘導した心筋細胞は生体内の心筋とほぼ同等の性質を持ち、心筋細胞移植が一歩現実に近づいたことを意味するものである。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】43,500千円 (直接経費: 37,200千円、間接経費: 6,300千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12557096 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞増殖 / 細胞分化 / サイトカイン / 肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から純化された肝幹細胞画分であるc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞を回収し、これらのクローナルな培養系を用いて、肝細胞および胆管細胞への分化誘導能を有する新規サイトカインのスクリーニングを行うことを目的として研究を行った。肝幹細胞から胆管細胞への分化誘導能を有する培養上清を得て、さらに、この培養上清の特定分子量分画にc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞の増殖抑制活性が限定的に存在することを確認した。この分子量分画から活性タンパク・ペプチドの精製を試みたが、結果として培養液中の血清の存在が困難要因となり精製には至らなかった。一方、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞に与える既知の各種サイトカイン、細胞外マトリックス、転写因子C/EBPsの影響に関するスクリーニング解析により、hepatocyte growth factor(HGF)やC/EBPsが肝幹細胞の初期分化に重要な役割を果たしていることを明らかにした(Development 130:2513-2524,2003)。
今後、肝幹細胞の分化・増殖機構を精度の高い解析系を用いて、ひとつひとつ丹念に検証していくとともに、実用化技術の開発に向けた疾患モデル動物における治療効果についても並行して検討する必要がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】9,800千円 (直接経費: 9,800千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】12307023 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 肝臓 / 幹細胞 / 再生

【研究成果の概要】

FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により、マウス胎児肝臓から肝幹/前駆細胞画分であるc-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞を選別・回収する技術を確立した。さらに、肝幹細胞の純化を進め、胎児肝臓中の僅かに0.3%を占めるにすぎないc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞中に限定的に肝幹細胞が存在することを明らかにした。そして、このc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞は、多分化能を維持したまま増殖可能で自己複製能を有していること、膵細胞や腸管上皮細胞など他の細胞系列の細胞へ分化する可塑性を有していることなどを明らかにした。これらのc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞が有する特性は、この細胞が厳密に定義し得る多能性肝幹細胞であることを如実に示している。これは、今まで概念としてしか捕らえられていなかった肝幹細胞の実体を初めて明確にしたという点で、幹細胞生物学的に意義の深い研究成果であったといえる。また、応用科学的側面からは肝幹細胞の分離・操作の基盤技術が確立されたといえ、今後の先進医療への応用が期待できる研究成果である。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】21,310千円 (直接経費: 19,000千円、間接経費: 2,310千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】11877192 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝臓 / 再生 / 幹細胞 / 再生医学 / 自己修復能

【研究成果の概要】

単離した肝細胞集団の中から、多能性を持つ肝幹細胞をFACS(Fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた細胞分離法により濃縮・純化し、それらの機能解析を行うことを目的として研究を行った。昨年度までの研究により、c-Kit-CD49f+CD29+ CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能の高いコロニー形成能を有した細胞が存在し、肝細胞と胆管細胞という異なる細胞系列へと分化し得ることを明らかにした(Hepatology 32(6):1230-1239,2000.)。今年度は、c-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞の画分化を段階的にすすめ、自己増殖能をも備えた幹細胞画分を明らかにすることを試みた。その結果、c-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞中に限定して増殖能、多分化能、自己複製能、組織再構築能を兼ね備えた肝幹細胞(hepatic stem cell)が高頻度に存在することが判明した。また、この肝幹細胞の少なくとも増殖にhepatocyte growth factor(HGF)が必須の因子であることを明らかにした。今後、さらに、純化した肝幹細胞の分化・増殖・自己複製機構を培養系を用いて解析し、「臓器再生」の基盤となる知見および技術を確立する予定である。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】2,000千円 (直接経費: 2,000千円)