【研究領域課題番号】20K06729 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

造血 / 造血幹細胞 / 両生類 / 造血因子 / オミクス / アフリカツメガエル / ネッタイツメガエル / 血球 / ゼノパス / 幹細胞 / 肝臓 / 脾臓 / 骨髄

【研究成果の概要】

ツメガエル（ゼノパス）の成体の造血は，肝臓，脾臓，骨髄の複数の造血器が分担して血球を産生する。そのため複数造血器の役割分担や組織環境の違いを解明するための魅力ある研究対象である。ツメガエルの各血球，すなわち赤血球，白血球，栓球（哺乳類の血小板の機能を担う細胞）はいずれも造血幹／前駆細胞（HSPC）が起源である。本研究では複数の造血器に存在するＨＳＰＣの特性の解明と分離法を確立しつつある。第２年度では第1年度で検討した細胞膜蛋白質を網羅的に同定するプロテオミクスにおいて、試料調製における界面活性剤処理の条件をさらに検討した。例えば飼育温度環境が異なるアフリカツメガエルの赤血球膜蛋白質をモデルにすると，飼育温度の違いによって，量的変動を示す赤血球膜上の膜蛋白質が比較解析可能になった。従ってこの方法を適用して複数臓器間のHSPC膜発現分子の差異が検出可能であると考えた。また細胞にレーザー光を照射して得られる散乱光とモノクローナル抗体２種の結合による蛍光を利用するフローサイトメトリーを用いて、肝臓ＨＳＰＣの分離法を検討した。再現性の確保が課題になるがN/C比が大きく未分化な細胞形態をもつ集団は，実験実施者に依存せずに再現性良く分離可能であった。このように進捗していたところ，シングルセルRNA-Seq（scRNA-seq）法によって１細胞単位で発現する全mRNAを同定，定量，分類する報告が相次いた。本研究の発展にとって，これらの新手法は大きな貢献をもたらすと判断し，特に肝臓，骨髄のＨＳＰＣを対象とするscRNA-seqを実現するための準備に入った。そのうち肝臓，骨髄それぞれの臓器からmRNAを回収するプロトコルをほぼ確定し，まずバルクmRNA解析に着手した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】19790955 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

胃癌 / 間葉系幹細胞 / 造血幹細胞 / 癌幹細胞 / 幹細胞 / 骨髄 / 骨髄由来細胞

【研究成果の概要】

われわれは、胃癌発生における骨髄由来細胞の関与について、胃腫瘍を自然発生するトランスジェニックマウスを用いて検証を行った。本研究では、骨髄由来細胞である間葉系幹細胞(MSC;GFPマウス骨髄由来)及び造血幹細胞(HSC;RFPマウス骨髄由来)を用いた混合移植を行った。結果として、胃癌の発生において、骨髄由来細胞であるMSC及びHCSの明確な関与は示唆されなかった。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】3,490千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 390千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】18590363 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

胃癌 / 幹細胞 / 発癌 / 骨髄 / クローン性 / 骨髄細胞 / 食道癌 / 化生 / 骨髄幹細胞 / 胃癌転移 / 胃発がん / ヘリコバクター / 骨髄移植 / 胃粘膜細胞分化 / 胃発癌

【研究成果の概要】

癌幹細胞が骨髄由来であるか否かをマウス化学発癌モデルを使用し、検討した。BALB/c雄性マウス17匹に放射線9Gyを照射したのちに、GFPマウスの骨髄細胞を移植した。骨髄移植のダメージから回復する2週間後からMNU240ppmを飲水中に含有させ、隔週5週間、9週にわたって投与した。17匹のうち、4匹はコントロールとし、13匹にMNUを投与した。その後、MNU投与から40週にて犠死せしめ、できた腫瘍中に骨髄由来細胞がとりこまれているか否かを検討した。40週の段階で生存しているMNU投与群は6匹のみであった。このうち4匹の前胃に偏平上皮癌が形成されていた。この腫瘍細胞はほとんどがGFP陰性であり、癌の由来は骨髄ではなく、もとからの組織であると考えられた。しかし、腫瘍のほんの一部にGFP陽性の細胞群からなるところがあり、骨髄由来細胞を幹細胞とする、または腫瘍形成後に骨髄由来細胞が取り込まれ、腫瘍形成の一部を成す可能性も考えられた。リンパ節に癌の転移を認めたが、これらはGFP陰性であり、転移巣内には新たな骨髄由来細胞の取り込みはなかった。転移巣はGFP陰性の原発巣からの転移と考えられた。
今回の結果からは、癌のすべてが骨髄由来であるという可能性は否定的であることがわかった。しかし、一部が骨髄由来である可能性は未だ否定できない。これはさらに詳しい検討が必要である。さらに、がんがモノクローナルな集団ではない可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,950千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 450千円)

【研究分野】眼科学

【研究領域課題番号】18591932 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

眼病理学 / ドライアイ / 移植片対宿主病 / 造血幹細胞移植 / 免疫学 / 線維芽細胞 / 線維化 / 間葉系幹細胞 / 幹細胞 / 慢性移植片対宿主病 / 涙腺 / マーカー / 骨髄

【研究成果の概要】

本研究では、マウスGVHDモデルを用いてドナー由来線維芽細胞の慢性GVHDの病態形成における役割を直接的に証明し、病態を解明することを目的とし本研究期間中に次の成果を得た。
マウスGVHDの涙腺、結膜、唾液腺、肺、皮膚、小腸、肝臓等慢性GVHDの病的線維化の経時的形成過程の作成に成功した。マウス線維芽細胞のマーカーとしてコラーゲン特異的分子シャペロンであるHSP47が適切であることを見いだした。これによりマウスドナー由来線維芽細胞の検出のためにHSP47とFISH法の組み合わせによりGVHDマウスの涙腺、結膜慢性GVHDにおける病的線維化部位においてドナー由来の線維芽細胞の検出に成功した。
さらに、GVHD線維化組織とコントロール組織から培養細胞にて涙腺および結膜の線維芽細胞株を樹立することに成功した。この培養線維芽細胞はGVHDとコントロールに形態および増殖能に差が認められており、GVHD涙腺結膜の線維芽細胞は増殖能が高く形態は小型でより扁平であった。今後この線維芽細胞株はGVHD線維化にかかわる線維芽細胞の病的な役割を検討し、治療効果の検討が解析可能となる点で重要である。
ドナー由来線維芽細胞の由来を検討するために間葉系幹細胞、造血幹細胞等の細胞源の同定のため、各種移植細胞源の除去移植を行った。造血幹細胞除去移植ではLineage陰性、Sca-1陽性、c-kit陽性細胞を選択的に除去移植し移植し線維化抑制は明瞭ではなかった。間葉系幹細胞除去移植では、全骨髄細胞から間葉系細胞に特異的マーカーを用いて選択的に除去して移植し各臓器の線維化抑制が認められた。線維化にかかわるドナー由来維芽細胞は間葉系幹細胞も候補のひとつとして考えられた。本研究は、慢性GVHDの研究および診断,線維化抑制のための新規治療開発に道を開く司能性がある点で意義があり、今後の臨床応用の可能性を秘めており造血幹細胞移植の成功率の上昇に貢献する可能性があり重要性があると考える。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】4,010千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 510千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】13470151 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

心筋細胞 / 骨髄間葉系幹細胞 / 分化誘導 / 再生医学 / 幹細胞 / CD抗原 / 細胞移植 / 骨髄 / 表面抗原 / FACS / 多分化能 / 多能性幹細胞 / 心不全 / 発生分化 / 間葉系幹細胞 / 細胞増殖因子 / サイトカイン

【研究成果の概要】

【目的】骨髄血より心筋分化能を有する可能性のある細胞を単離し、増殖し、分化誘導を試みた。
【方法】(1)骨髄血よりauto MACSを用いて、CD45陰性、CD29陽性、CD34陰性、CD44陽性の細胞群を単離し、ファイブロネクチン塗布培養皿上に接着させた。(2)この細胞を培養し、細胞の増殖曲線を作成した。(3)この細胞の表面抗原をFACS解析した。(4)この細胞をインスリン存在下で培養し、脂肪細胞への分化を観察した。(5)この細胞を0.1mMデキサメサゾン、0.05mMアスコルビン酸-2リン酸、10mMβ-グリセロフォスフィト存在下で培養し、骨芽細胞への分化を観察した。(5)この細胞を既知の種々の増殖因子で刺激し、心筋分作を観察した。
【結果】(1)骨髄血より上記表面抗原の抗体を利用することにより、付着系の間葉系幹細胞が回収できた。この細胞は,in vitroである程度増殖させることが可能であった。(2)CD29陽性、CD45陰性、CD44陽性、CD34陰性、CD13陰性、CD49e陽性であった。(3)インスリン存在下ではこの細胞は脂肪細胞に分化した。(4)デキサメサゾン、アスコルビン酸-2リン酸、β-グリセロフォスフィト存在下ではこの細胞は骨芽細胞に分化した。フォンコッサ染色陽性の細胞が観察された。(5)この細胞はIGF-1,FGF, TGFb, LIF, EGF, PDGF,エンドセリンでは心筋分化の誘導活性は無かった。しかし、Wntにより心筋特異的転写因子の一部が誘導された。
【結論】骨髄血細胞中の間葉系幹細胞はある種の増殖因子により心筋分化が誘導されると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】16,400千円 (直接経費: 16,400千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】12307016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 骨髄 / 心筋細胞 / 再生 / 心不全 / 細胞分化 / 細胞移植 / 再生医学 / 骨髄細胞 / 発生

【研究成果の概要】

本研究では骨髄間質細胞を分化誘導することにより心筋細胞を作製し、心不全治療に応用しうるレベルに至るまでの基礎研究を行った。今回の一連の研究を通して、(1)骨髄中の多分化成体幹細胞を用いることにより心筋細胞が分化誘導できること、(2)この現象はマウスのみでなく、ヒトの骨髄成体幹細胞を用いても再現できること、(3)骨髄由来の心筋細胞は胎児期心室筋の表現型を取ること、(4)分化当初は洞結節型の活動電位を呈するが、分化とともに心室筋型の活動電位を呈すること、(5)交感神経α1受容体を発現し、心肥大作用を伝達すること、(6)交感神経神経β受容体を発現し、陽性変時作用、陽性変力作用を伝えること、(7)副交感神経ムスカリンM2受容体を発現すること、(8)蛍光色素GFPと心筋特異的プロモーターを使用することにより、心筋細胞のみを単離出来ること、(9)単離した再生心筋細胞を心臓内に移植すると、心臓内で長期間生着出来ること、(10)このような幹細胞は心筋梗塞などの心筋の壊死炎症がある状況では拘束部位に移動し、心筋やほかの細胞に分化する能力を持つこと、(11)ある種のサイトカインは骨髄から幹細胞の移動に積極的に働くこと、(12)幹細胞と心筋細胞の共培養は幹細胞の心筋分化を誘導する可能性のあること、(13)心筋分化能のある骨髄成体幹細胞の表面抗原はヒトとマウスで異なること、(14)ヒトの骨髄成体幹細胞はin vitroで長期間培養するとテロメアの長さの関係で細胞増殖できなくなるが、いくつかの遺伝子導入を行うことにより、細胞増殖できるようになることなどが明らかとなった。このことは骨髄成体幹細胞から分化誘導した心筋細胞は生体内の心筋とほぼ同等の性質を持ち、心筋細胞移植が一歩現実に近づいたことを意味するものである。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】43,500千円 (直接経費: 37,200千円、間接経費: 6,300千円)