【研究領域課題番号】21H04952 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨再生 / 幹細胞 / 一細胞解析 / hPSCs / 骨誘導 / ヒト多能性幹細胞 / ゲノム編集

【研究成果の概要】

2021年度は当研究室で開発したヒト多能性幹細胞由来三次元骨組織を用いた解析を行った。まず、ヒト多能性幹細胞から椎板細胞（骨軟骨前駆細胞）へのStepwise分化誘導を行った。RT-qPCRにより誘導効率を確認した後、誘導細胞を免疫不全マウス腎被膜下へ移植し三次元骨組織を誘導した。骨組織はin vivoマイクロCTにより経時的に観察し、骨構造が十分に形成されたことを確認した。誘導骨組織は、異なる日数経過後に取り出し、10x Genomics社のChromium解析プラットホームを用いて、一細胞RNA-seq（Single Cell RNA-seq）解析を行った。具体的には、組織から酵素処理により細胞を単離した後、10x Genomics社のChromium解析プラットホームを用いて、一細胞ごとに分子バーコードを付加した後、cDNA逆転写反応とDNAライブラリーの構築、および次世代シーケンサーNova-seqを用いたシークエンスを行った。得られたシークエンスデータに対して、東京大学医科学研究所スーパーコンピューターShirokaneを用いたバイオインフォマティクス解析を行った。Cell Rangerを用いてリファレンスゲノムGRCh38へマッピングした後、正規化・クラスタリングおよび次元圧縮解析により、類似の遺伝子発現により特徴づけられる細胞集団を同定した。既知の細胞分化マーカーやデータベースを参照し、各細胞集団のcharacterizationを行った。その結果、マウス由来の血球系細胞集団と、ヒト由来の骨格系組織が得られたことが確認できた。以上より、本手法により得られた骨組織はヒト骨格系細胞集団とマウス血球系細胞のキメラ構造を有していることが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2021-04-05 - 2025-03-31

【配分額】40,950千円 (直接経費: 31,500千円、間接経費: 9,450千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】15H05044 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨再生 / 間葉系幹細胞 / 同種細胞移植 / 遺伝子 / 生体材料 / 骨芽細胞分化 / 再生医学 / 臍帯 / 幹細胞 / 骨分化 / リプログラム / 遺伝子活性化基質

【研究成果の概要】

本研究の目的は、in vivo Direct Conversionを誘導する遺伝子活性化基質によって、生体内で臍帯由来MSCを骨芽細胞へ直接分化させることで、簡便で確実な骨組織の再生法を開発することにある。 即ち、培養により大量に増殖させた臍帯MSCと、骨芽細胞分化を誘導する遺伝子群を組み込んだ基質を一体化して骨欠損部へ移植することで、顎骨の再生を図る。本研究期間中の成果としては、細胞骨格因子であるアクチンの脱重合に関わる遺伝子群とBMPシグナルの制御に関わるmiRNA群をGAMに応用し、それを臍帯MSCの担体とすることで骨再生を促す技術の可能性について一定の知見を得ることができた。

【研究の社会的意義】

本研究の独創的な点は、臍帯MSCの利点を最大限に活用するin vivo Direct Conversionの手法によって、骨芽細胞分化と血管網構築の両面から効果的に骨再生を成し遂げようとするところである。本研究の研究分担者らは、様々な希少・難治疾患に対する臍帯MSCの応用研究を実施しており、そのための系統的資源化を推し進めている。同種移植可能で、安定供給が可能である細胞による効果的な骨再生法を開発できれば、革新的な細胞治療法が実現する。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,160千円 (直接経費: 13,200千円、間接経費: 3,960千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】25670846 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 骨代謝学 / 細胞周期 / 細胞分化 / 幹細胞 / 骨形成 / 骨吸収 / 骨軟骨分化 / 骨再生

【研究成果の概要】

本研究では、細胞周期制御との関連が強いRunx2と同じruntファミリーに属するRunx1とRunx3が間葉系細胞の骨分化能促進機能を有すること、ならびに、高分化能を有する間葉系細胞において古典的Wnt経路の抑制によってサイクリンD1発現が抑制されており、サイクリンD1が骨軟骨分化の振り分け機能を有すること、を明らかとした。さらに細胞周期制御において重要な機能を果たしていると想定された分子の中から、破骨細胞分化の際に発現が上昇する一方で骨芽細胞分化の際に発現が低下する分子、逆に破骨細胞分化の際に発現が低下する一方で骨芽細胞分化の際に発現が上昇するという発現変動パターンを示す分子を複数同定した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】22390291 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ES cell / iPS cell / stem cell / 軟骨再生 / Scaffold / 軟骨分化 / 骨分化 / Stem cell / scaffold / 幹細胞 / 組織工学 / 骨再生 / スキャフォールド

【研究成果の概要】

今までに確立したヒト滑膜間葉系幹細胞（MSC）由来三次元人工組織（Tissue Engineered Construct, TEC）を作製する技術を用いて、ウサギ胚性幹細胞由来MSCでTEC（ES-TEC）を作成した。ES-TECは軟骨分化誘導後に滑膜MSC-TEC(Sy-TEC)と比べ軟骨関連遺伝子の発現が有意に高値であった。ウサギ膝関節骨軟骨欠損へのTEC/β-TCP複合体移植を行いに修復組織を検討したところES-TECでSy-TECに比しては硝子軟骨様組織による修復が促進されており、臨床応用が期待できる。またiPS細胞を用いて短期間でTECを作成する技術も開発した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010-04-01 - 2014-03-31

【配分額】18,200千円 (直接経費: 14,000千円、間接経費: 4,200千円)

【研究分野】医用生体工学・生体材料学

【研究領域課題番号】16200032 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生骨 / 組織エレメント / 幹細胞 / 移植 / TCP / 力学特性 / 骨組織 / 凝集塊 / 骨再生 / 組織工学 / 骨髄由来細胞 / 細胞凝集体 / リン酸三カルシウム / 血管新生 / 細胞凝集塊

【研究成果の概要】

骨の発生段階で起る細胞間相互作用を生体外で再現することによって,短時間で骨様の特徴を惹起する組織体(微小骨エレメント)を作製し,あらゆる骨欠損に適応可能な培養骨の開発を目指した.ヒト骨髄から採取した間葉系細胞(MSC)を培養により増殖させたのち,非接着性のwell中に高密度播種し,旋回培養することにより,大量の細胞凝集体を作製した.また,8週令のヌードラットの頭蓋冠骨に骨欠損(直径8mm)を作り,MSC凝集体や人工材料(β-TCP顆粒),それらを併用したものをサンプルとして移植した.移植後8週目でラットを屠殺し,μCTによる観察,組織切片の染色(H.E.染色),及び力学試験(3点曲げ試験)により評価した.
作製したMSC凝集体にCalcein・PI二重染色を施し観察した結果,細胞の壊死は殆ど見られず,細胞の生が確認できた.また,MSC凝集体をヌードラット骨欠損モデルに移植に使用したサンプルにおいて,H.E.染色により新生骨の形成が確認された.また力学試験の結果,強度は既存骨に劣るものの,十分な強度を持っていた.一方,MSC凝集体とβ-TCP顆粒を併用したサンプルでは,新生骨の形成は確認されたものの,β-TCP顆粒が残存していた.また,力学的強度はMSC凝集体のみを移植したサンプルに比べて低くなった.また,β-TCP顆粒のみを移植に用いたサンプルでは,新生骨の形成は確認されず,β-TCP顆粒は残存し,力学的強度はさらに低くなった.以上より,MSC凝集体のみを用いる骨再生法は組織学的,力学的観点において,β-TCP顆粒を用いる骨再生法よりも優れている可能性が見出された.

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2004 - 2007

【配分額】48,230千円 (直接経費: 37,100千円、間接経費: 11,130千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】14571403 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ハイドロキシアパタイト / 脊椎固定術 / 幹細胞 / 骨再生 / rhBMP-2 / ラット / ヌードマウス / 培養骨 / 骨芽細胞 / BMP

【研究成果の概要】

平成14年でのMC3-T3細胞、骨髄細胞を用いたin vitro実験の結果、ハイドロキシアパタイトファイバーシート(HAシート)は、気孔率、気孔径の調節が自在にでき、細胞の三次元培養が可能であると同時に、その高い生体親和性から、蛋白の担体としても利用可能と考えられる.平成14年度に作製した、ラット脊椎固定術モデルを用いて、平成15年度は、(1)recombinant human bone morphogenetic protein-2(rhBMP-2)を付加したHAシートをrhBMP-2のcarrierとして利用し、脊椎固定術に応用可能か(2)骨芽細胞を内部で培養したHAシートが骨再生のscaffoldとして利用可能か、移植実験動物モデルへの移植を行い評価した.実験(1):ラット脊椎固定術モデルに対し,異なる量のrhBMP-2(5,10,15μg)を付加したHAシートを移植骨として用い、第5〜6腰椎間両側後側方固定術を施行した.術後腰椎を一塊として摘出,骨癒合の有無を評価した.実験(2):1日齢ラット頭蓋骨由来の骨芽細胞様細胞を培養シャーレで培養後、トリプシン処理で細胞懸濁液を作成した.これを気孔率と気孔径が95%、5μm(SO)、99%、250μm(S2000)の2種類のHAシートに5×10^6個の細胞数で播種し、2週間培養した.それらをヌードマウス皮下に移植し、1〜4週目に試料を摘出、光顕による観察を行った.実験結果(1):10,15μg付加群の全例で移植後4週以内に骨癒合を得た.実験結果(2):移植後早期には、S2000のほうがより多くの細胞がシート内部に三次元的に付着、増殖していた.しかし移植後4週目以降は、S2000では元の約半分の大きさに縮小、内部の細胞も減少したが、力学的強度で勝るSOでは内部に軟骨細胞様細胞が充満し、旺盛な内軟骨性骨化を認めた.よってHAシートは、骨再生における骨芽細胞のscaffoldとしても使用可能であるだけでなく、rhBMP-2の担体として有用であり、脊椎固定術へも応用可能と考えられた.

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】2,500千円 (直接経費: 2,500千円)