【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】15100007 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

カスパーゼ / ショウジョバエ / 遺伝学 / 神経発生 / IAPファミリー / イメージング / キナーゼ / プロテアソーム / 神経細胞死 / ショウジョウバエ / 神経変性 / タンパク質分解 / アポトーシス / JNK / 蛋白質分解 / 神経細胞 / 細胞死 / 発生 / マウス / 細胞選択

【研究成果の概要】

ショウジョウバエ遺伝子の過剰発現スクリーニング(GSスクリーニング)を取り入れることで、神経細胞死シグナルの機能的的ゲノムスクリーニングを行った。ポリグルタミンによる神経細変性に関与する遺伝子として小胞体に存在する不良品蛋白質の輸送チャネル(Sec61α)を同定した。Sec61αは、分泌経路で合成される蛋白質の小胞体への移行と、小胞体関連タンパク質分解Endoplasmic Reticulum Associated Degradation : ERADにおいて小胞体から細胞質への不良品タンパク質の輸送を担う重要なチャネルである。Sec61αをショウジョウバエ複眼や培養細胞で過剰発現すると不良品タンパク質が細胞質に逆輸送されて蓄積し細胞死が誘導されること、逆にSec61αの活性を遺伝学的に弱めることによりポリグルタミン病モデルにおいて細胞質に蓄積していた不良品タンパク質が減少し、晩発性の神経変性が回復することが明らかになった。さらに、GSスクリーニングによって、神経細胞死シグナルを発する候補遺伝子としてDmIKKεが得られた。遺伝子の機能欠損スクリーニングによってもDmIKKεが得られ、細胞死を誘導しないレベルのカスパーゼ活性を調節することを見いだした。細胞死シグナルに関与する遺伝子のスクリーニングからDmIKKεが得られたことをふまえてその基質を探索した結果、種を超えて保存されたカスパーゼ抑制因子DIAP1が同定された。DmIKKεはDIAP1をリン酸化することによってその分解を促進する。DmIKKεを生体でノックダウンすると内在性のDIAP1レベルが組織で上昇した。しかし、この状態でも発生過程での細胞死は正常におこり、ここでのDmIKKεによるDIAP1レベルの調節は細胞死以外の生理機能に関与することが示唆された。本研究が明らかにした段階的なカスパーゼ活性化による神経選択の新たな仕組みは、発生と神経変性での細胞運命決定機構に新たな視点をもたらしたものである。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2003 - 2006

【配分額】119,080千円 (直接経費: 91,600千円、間接経費: 27,480千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13770114 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

EAT / ノックアウト・マウス / bcl-2 / 発生 / 初期胚 / 胎児性癌 / 胚性幹細胞 / アポトーシス / 分化 / 胎児性癌細胞 / 遺伝子ノックアウト法

【研究成果の概要】

EAT遺伝子は、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子として単離され、bcl-2関連遺伝子に属する。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制することが示されている。本遺伝子のノックアウト・マウスは胚性致死であることが知られている。本研究では、さらにEATの発生段階および個体レベルでの機能を詳細にするために、マウスEC、ES細胞においてEATを欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、コンディショナル・ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行なうことを目的とする。
1.EATをコンディショナルにノックアウトするためのターゲッティング・ベクターを作製した。EATは、3ヶのexonからなるが、(1)exon1の両端にloxP配列を挿入したベクターおよび、(2)exon2の両端にloxP配列を挿入したベクターの2種類のターゲッティングベクターの作製を終了した。
2.上記ターゲッティング・ベクターをF9細胞、ES細胞に導入し、一方の対立遺伝子でexon1を挟むようloxP配列が挿入されたES細胞を10クローンを得た。現在これらのクローンを用いてマウスを作製している。
EATは初期胚発生過程のみならず、成獣の多くの臓器(主に上皮)で発現している。コンディショナル・ノックアウトマウスを作製し、成獣でEAT遺伝子をノックアウトすることにより、EATが機能している臓器やEATが果たしている機能が解明されると期待される。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】実験病理学

【研究領域課題番号】13470053 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / 発生 / EAT遺伝子 / ES細胞 / コンディショナル・ターゲッティング / bcl-2ファミリー / 遺伝子改変マウス / EAT / bcl / mcl-1 / mcl1 / トランスジェニック・マウス / ミトコンドリア / 細胞死

【研究成果の概要】

EAT/mcl1遺伝子は、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子として単離され、bcl-2関連遺伝子に属する。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制すること、本遺伝子を過剰発現するトランスジェニック・マウス(Tg)では、膵ラ氏島の過形成が生じることが知られている。本研究では、EAT/mcl1の発生段階および個体レベルでの機能を更に詳細にするために、胚性幹細胞(ES細胞)においてEAT/mcl1を欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行った。
Cre-loxPシステムを用いてEAT/mcl1遺伝子をマウス個体、ES細胞においてコンディショナルにノックアウトするために、EAT/mcl1のexon 1をloxPで挟むような変異を導入するターゲッティング・ベクターを導入することによりES細胞(TT2細胞)の一方の対立遺伝子に変異を導入することに成功した。11個のES細胞のクローンが得られ、5個のES細胞をマウス初期胚(胚盤胞)へ注入することによりキメラマウスを得た。それらより3ラインのマウスのラインを確立した。これらのマウスをCre recombinaseを発現するトランスジェニック・マウスと交配することにより以下のマウスを得た。1)EAT/mcl1のexon 1が破壊されたマウス(EAT/mcl1遺伝子1個のみ破壊されたヘテロ接合性のノックアウトマウスであり、表現形は、現在のところ、形態学的には野生形と同様と考えられる。このことはEAT/mcl1の発現量が通常の1/2となってもマウスは、正常に発生.分化することを示唆している)。2)EAT/mcl1のexon 1の両端にloxP配列が挿入されたマウス(このマウスは、両アレルとも正常なEAT/mcl1を有するが、臓器特異的Creトランスジェニック・マウスの交配により、コンディショナル・ノックアウトを作成することが可能である)。また、MEOXマウス(胎生5日目以降に、胚盤葉上層(将来、胎仔となる領域)特異的にCre recombinaseを発現するマウス)の導入を終了した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2004

【配分額】14,100千円 (直接経費: 14,100千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】09044264 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / サイトカイン受容体 / シグナル伝達 / アポトーシス / 造血 / 生殖細胞 / 血管内皮細胞 / 発生 / オンコスタチンM / 血管内皮 / セルトリ細胞 / 始原生殖細胞 / 細胞増殖 / 細胞分化 / 細胞死 / 白血病

【研究成果の概要】

造血細胞の生存はサイトカインに依存しており、サイトカイン除去により細胞死が誘導される。我々はすでにこのサイトカインによる細胞死抑制機能にはサイトカインにより活性化されるRASが重要であることを示した。そこで、RASの変異体を用いてRAS下流のシグナル経路の解析を行い、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を介して細胞死を抑制していることを明かにした。一方、サイトカイン非存在下ではCaspase-3が活性化され、それがサイトカイン除去に伴う細胞死に重要であることも明らかにした。また、我々はサイトカインで誘導される分子としてオンコスタチンM(OSM)を同定していたので、その機能を検索した。造血発生の場として知られている胎生期のAGM(aorta/gonad/mesonephros)領域にOSMの発現を認め、マウスAGM領域の細胞を培養する系にてOSMが血球産生と血管内皮細胞の増殖を促進することを見いだし、OSMが血球と血管内皮に共通の前駆細胞hemangioblastsに作用する可能性を示した。さらに、この培養系を用いて、血球産生に必須な転写因子c-myb,AML-1の作用を解析した。また、OSMは生殖細胞とセルトリ細胞にも作用することを見いだした。さらに、マウスOSM受容体の生化学的解析およびマウスOSM受容体遺伝子クローニングにより、機能的な受容体の分子構造を明らかにし、ヒトOSMとの相違を明らかにした。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】5,500千円 (直接経費: 5,500千円)

【研究分野】形態系基礎歯科学

【研究領域課題番号】09557141 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ASKl / アポトーシス / MAPキナーゼ / Traf / Daxx / ASK1 / 口腔組織 / 発生

【研究成果の概要】

本研究はASK1(Apoptosis Signal-regulating Kinase 1)のアポトーシスシグナル伝達機構の解析を通して、顎顔面口腔発生過程でのプログラム細胞死と形態形成機構の総合的理解を得ることを目的としており、本年度は特にASK1結合蛋白質によるASK1活性化機構の解析を進めた。
(1) ASK1抑制性制御分子としてのチオレドキシンの同定 : ASK1活性化の分子機構を明らかにする目的で、酵母two-hybridシステムを用いASK1結合タンパク質の解析を行ったところ、酸化還元(レドックス)タンパク質、チオレドキシン(Trx)がASK1のN末端に直接結合することを見いだし、チオレドキシンがASK1の特異的抑制因子として活性酸素種によるASK1活性化を介したアポトーシスにおける負の制御機構に寄与していることを明らかにした。
(2) ASK1活性化制御分子としてのTRAF2の同定 : TNFのシグナル伝達分子であるTRAF2の直接的なエフェクター分子としてのASK1の可能性について検討を行なったところ、TRAF2はASK1に結合するとともにASK1を活性化し、TNFシグナル伝達におけるJNK pathwayにおいてTRAF2-ASK1経路がたいへん重要な位置を占めることが明らかにされた。
(3) ASK1活性化制御分子としてのDaxxの同定 : Fasからのシグナル伝達分子DaxxとASK1の関連性について検討したところ、DaxxはASK1に結合するとともにASK1を活性化し、Fasシグナル伝達におけるJNK pathwayにおいてDaxx-ASK1経路が生理的役割を持つことが明らかにされた。
以上のように本年度はASK1活性制御分子メカニズムとしてひとつの抑制因子とふたつの活性化因子の同定に成功した。今後はこれらの分子機構を介したシグナル伝達が顎顔面口腔発生過程でのプログラム細胞死にどのように関わっているかを生体内で明らかにする必要がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】11,000千円 (直接経費: 11,000千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07409001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカン / サイトカン受容体 / シグナル伝達 / 造血 / アポトーシス / 分化 / RAS / STAT / サイトカイン / サイトカイン受容体 / 血管内皮 / 発生 / 誘導遺伝子 / 細胞分化 / 造血因子 / JAK / Ras / 幹細胞 / 造血細胞 / 増殖 / 細胞死 / キナーゼ / 細胞増殖

【研究成果の概要】

IL-3/GM-CSF/IL-5受容体の変異体を使ったシグナルの解析からRASとSTAT5という二つの主要なシグナル伝達経路が明らかになってきたので、これらの活性化とサイトカイン機能との関連を中心に研究を展開した。造血細胞はその増殖だけでなく、生存にもサイトカインによる刺激を必要としており、RASの活性化は造血細胞においては細胞死の抑制に重要であることを明らかにした。さらに、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していること、またサイトカイン除去による細胞死にもcaspaseが関与することなどを明かにした。一方、多くのサイトカインはSTAT5を活性化するが、その生理的意義を明らかにするために、STAT5誘導性遺伝子の分離を行い、SH2ドメインをもつ新規シグナル分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatin M(OSM)などを同定した。CISはサイトカインのシグナルをnegativeに制御する分子であることを示した。優勢抑制型のSTAT5変異体を用いた実験から、STAT5が造血細胞の細胞あるいは赤芽球分化に重要な機能をもつことを明らかにした。さらに、STAT5とRASによるシグナル経路がクロストークすることも示した。STAT5誘導遺伝子として同定されたOSMの機能の検索を行い、胎生期での血球発生過程や生殖細胞などに作用があることを示した。また、遺伝子クローニングによりOSM受容体の分子構造も明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1998

【配分額】36,500千円 (直接経費: 36,500千円)