【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】24791721 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

卵管 / 幹細胞 / side population / 子宮内膜

【研究成果の概要】

卵管幹細胞の同定に必要なin vivo卵管組織再構成システムの確立に際して、その基盤となる技術開発を不死化内膜間質細胞と不死化内膜腺上皮細胞を用いて行った。まず、これらの細胞株を出発材料として、発光・蛍光蛋白を安定的に発現する細胞株を作成した。さらに、標識細胞が組織再構成の過程のなかで、どのように振る舞うかを検証する細胞追跡システムを開発した。本研究により、不死化卵管上皮細胞株が利用可能になった際、その再構成システムと幹細胞追跡法への応用が可能な基盤知見が得られた。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】人体病理学

【研究領域課題番号】20249022 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

EBウイルス関連胃癌 / EBウイルス / 胃癌 / エピジェネティクス / LMP2A / SP細胞 / トランスジェニックマウス / マイクロRNA / 幹細胞 / エクソソーム / DNMT1 / STAT3 / 転写因子 / RRM2 / miR200 / 上皮間葉転換 / 胃癌細胞株

【研究成果の概要】

Epstein-Barrウイルス(EBV)関連胃癌において,プロモーター領域CpG部位のメチル化がゲノムワイドに起こっていることを明らかにした.胃癌細胞株MKN7にEBウイルスを感染させ,ゲノムワイドDNAメチル化異常を再現することに成功し,分子機構解明に重要な実験系を確立した.また,潜在期ウイルス遺伝子蛋白LMP2AがDNAメチル化異常に関与していることを明らかにするとともに,DNAメチル化,プロテオソーム等に対する阻害剤を用いたウイルス再活性化療法の可能性について検討した.

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2008 - 2012

【配分額】50,310千円 (直接経費: 38,700千円、間接経費: 11,610千円)

【研究分野】病態検査学

【研究領域課題番号】19659144 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 神経成長因子 / 遺伝子導入 / アデノウイルス / がん幹細胞 / 神経膠腫 / SP細胞

【研究成果の概要】

幹細胞への外来遺伝子の導入に必要な諸条件を検討した。この際、骨髄由来間葉系幹細胞を標的細胞として用い、幹細胞のマーカーとして、CD271に着目した。CD271は神経成長因子受容体(NGFR)であるが、未分化性を維持させる分化制御因子としての作用を有する。間葉系幹細胞として、イヌ骨髄液から磁気ビーズ法によりCD271陽性分画を回収し、この細胞集団が高い増殖性と未分化性を維持していることを確認した。また、前年度開発した相同組換えを応用したアデノウイルスゲノム上への外来遺伝子挿入技術を応用し、筋分化誘導因子であるMyoD発現ベクターを構築した。このベクターを分化誘導スイッチとして用い、間葉系幹細胞で一過性にMyoDを強制発現することにより、簡便な細胞分化誘導方法を確立した。この際、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を併用することによって、分化誘導効率が改善できることを見出した。まず、分化誘導細胞をマウス骨格筋に移植し、移植細胞の生着を確認した。同時に、炎症制御因子IL-10を局所的に作用させると移植効率が向上することを確認した。さらに、ビーグル犬を用いて同種移植を実施した。リンパ球抗原の一致した個体間でドナーとレシピエントを選定し、分化誘導因子遺伝子を導入したドナー由来細胞をレシピエントの前肢および後肢に局所移植したところ、移植細胞は移植領域に3ヶ月間にわたり生存・生着していることが確認できた。生着細胞は筋線維様の形態を示しており、分化マーカーの発現様式から組織再生過程にあることが示唆された。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】3,100千円 (直接経費: 3,100千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】17590682 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

side population(SP)細胞 / 幹細胞 / 幹細胞移植 / 肝不全 / 肝硬変 / 肝細胞移植 / 初代培養肝細胞 / 脾臓 / side population (SP)細胞

【研究成果の概要】

末期肝硬変患者の主な死因は肝不全と癌である。現在、末期肝硬変患者の肝不全に対する根本的な治療法は肝移植であるが、圧倒的なドナー不足および拒絶や免疫抑制剤使用に伴う合併症など課題も多い。また、癌死する患者の中には、残存肝機能が乏しく、癌に対して十分な治療が行えなかった症例もある。そんな中で、肝不全に対する新しい治療法として、細胞移植療法が注目され、まず肝細胞移植が試みられたが、ドナーが必要であることや免疫反応の問題は変わらぬ課題である。そこで我々は、自家幹細胞移植による肝再生で肝機能改善が得られれば、治療の選択肢が増えると考えた。我々はすでに、成人組織幹細胞に培養下で肝細胞機能を獲得させることに成功した。我々はすでに、脾臓SP細胞および骨髄問葉系細胞を、アルブミンやサイトケラチン18といった、肝細胞特異的蛋白質を発現させることに成功した。また、脾臓SP細胞を肝障害ラットの肝臓へ直接注入する方法で移植し、移植細胞の生着とアルブミンの発現を確認した。また、脾臓SP細胞が骨髄と比べて約100倍程度多い事から、より有望な幹細胞供給源であることを発見した。正常ラット、マウス、ヒトの脾臓から全脾臓細胞の1〜3%のSP細胞が存在する事、さらに持続肝傷害動物モデルを用いて脾臓SP細胞の表面抗原プロファィル、分化能、増殖能等の検討を行った結果増殖能力が著しく上昇していることが確認された。また脾臓SP細胞の単独浮遊培養系において持続肝傷害モデル由来の脾臓SP細胞が細胞死抵抗性を獲得しこれがFasの発現低下によるものであることが推測された。また網羅的遺伝子解析により新規介在分子の存在が示唆された。さらに実際の臨床において、脾臓を摘出した症例から脾臓SP細胞を分離したところ同様に肝傷害症例のほうがリンパ腫、血小板減少症などの非肝傷害症例より有意に多いSP細胞を有することが確認できた。移植経路として、末梢経路と門脈経路を比較検討したところ、門脈経路の方が有効性が高く、さらに複数回投与した方が効果が大きいことが判明した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】2,500千円 (直接経費: 2,500千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】16209024 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

腸管上皮 / 幹細胞 / musashi-1 / 炎症性腸疾患 / Wntシグナル / SP細胞 / 粘膜再生療法

【研究成果の概要】

腸管上皮の幹細胞を同定し、その幹細胞を特徴づけるマーカーを見いだし、全能性幹細胞あるいは造血幹細胞から上皮幹細胞への分化過程を追究し、胚性幹細胞、上皮幹細胞を損傷粘膜に移入することにより腸管上皮を再生する治療法を開発することを目的とした。
まず、hoechst33342染色を用いることにより、腸管上皮幹細胞の純化を試みた。マウス腸管より採取した腸管上皮細胞よりSP細胞を解析したところ、腸管上皮においてSP細胞の存在が確認された。腸管上皮幹細胞の多く存在する陰窩上皮ではSP細胞が高率に認められたことに対し、絨毛上皮ではSP細胞は認められなかった。ABCG2の発現はSP細胞とMP(main population)糸田胞の間に有意な差を認めなかった。また、c-kit、Sca-1は腸管上皮細胞では発現が認められなかった。腸管上皮幹細胞の増殖・分化に重要とされるβ-catenin、神経幹細胞マーカーであるmusashi-1の発現はSP細胞において増加していることを見いだした。
さらに、Wntシグナルに焦点を絞って解析を進めた。まず、TOPGFP、TOPGALマウスの作成によりWntシグナルの可視化を行った。TOPGFP hi細胞はMusashi-1、c-mycなどのimmature markerの発現が高く、iFABPなどのmature markerは低かった。TOPGFP、TOPGALは4系統の細胞にcarry overしており、多分化能を有することが示唆された。TOPGFPhi、LRCはともにintegrinβ1 hi, CD24+,CD71+/-のsurface phenotypeを有し、TOPGFP hiにはLRCを多く含んでおり、TOPGFP hi細胞がputativeな腸管上皮幹細胞であることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】50,180千円 (直接経費: 38,600千円、間接経費: 11,580千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】14370192 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

腸管上皮 / 幹細胞 / SP細胞 / musashi-1 / 炎症性腸疾患 / 粘膜再生療法

【研究成果の概要】

本研究では、腸管上皮の幹細胞を同定し、その幹細胞を特徴づけるマーカーを見いだし、全能性幹細胞あるいは造血幹細胞から上皮幹細胞への分化過程を追究し、胚性幹細胞、上皮幹細胞を損傷粘膜に移入することにより腸管上皮を再生する治療法を開発することを目的とし、前年度に引き続き腸管上皮幹細胞の同定・純化およびその解析を行った。まず、我々はhoechst3332染色を用いることにより、腸管上皮幹細胞の純化を試みた。マウス腸管より採取した腸管上皮細胞よりSP細胞を解析したところ、腸管上皮においてSP細胞の存在が確認され、陰窩上皮ではSP細胞が高率に認められたことに対し、絨毛上皮ではSP細胞は認められなかった。また、β-cateninのリン酸化状態を検討したところ、陰窩上皮では脱リン酸化したβ-catenin陽性細胞が高頻度にみとめられた。膜表面のインテグリンα6の発現は低下していた。次に胎仔マウス腸管より上皮細胞を分離して検討すると、多数のSP陽性細胞が存在していた。幹細胞のマーカーである脱リン酸化β-cateninとmusashi-1の発現はMP(main population)分画に比してSP分画において増加していた。しかし、ABCG2の発現はSP細胞とMP細胞の間に有意な差を認めなかった。これらの結果により、SP分画を用いることで、これまで困難とされてきた腸管上皮幹細胞の純化の可能性が示唆された。また、腸管上皮幹細胞において、WntシグナルとNotchシグナルの協調作用が腸管上皮幹細胞の増殖、分化にとって重要であることが示唆され、粘膜再生治療法を開発する上で重要な知見であると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】14207026 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

SP細胞 / 幹細胞自家移植療法 / コラーゲンゲルサインドイッチ法 / 肝細胞分化誘導法 / 肝細胞分化 / 脾臓 / 自家細胞移植 / 肝再生 / 細胞融合 / 移植医療 / 肝硬変 / 肝不全 / 初代培養肝細胞 / コラーゲンゲル / 幹細胞

【研究成果の概要】

1.in vitroの肝細胞分化誘導法の確立
1)コラーゲンゲルサンドイッチ法を用いた初代培養肝細胞培養法
細胞をコラーゲンゲルの上に播種し、さらにコラーゲンゲルを重層する方法による初代培養肝細胞培養法を用いることで、肝細胞の分化機能が維持されるだけでなく、いったん脱分化した肝細胞の再分化誘導が可能であることを、アルブミン産生能を指標に証明した。
2)コラーゲンゲルサンドイッチ法を用いた幹細胞の肝細胞分化誘導法
いったん脱分化した肝細胞が再分化する際の微小環境が、幹細胞を肝細胞へ分化誘導すると考え、コラーゲンゲルサンドイッチ法を応用して共培養を行った。骨髄細胞の単核球分画を用い、アルブミン、サイトケラチン18などの肝細胞特異的マーカー蛋白の発現誘導に成功し、幹細胞候補をin vitroで肝細胞分化誘導する極めて安定した簡易なスクリーニング法であることを証明した。
2.成人組織幹細胞の分離と解析
1)肝臓、骨髄、脾臓からのSP細胞採取法の確立
1996年にGoodellらが発表したDNA結合色素Hoechst 33342の排泄能が高い細胞=side population(SP)細胞という概念に基づく幹細胞分離方法を用いて、成人ラットの肝臓・骨髄・脾臓から成人組織幹細胞を採取することに成功した。ラット脾臓では、骨髄以上の存在率でSP細胞を認めた。
2)SP細胞の肝細胞分化誘導
採取したSP細胞を、上述の方法で、in vitroでの肝細胞誘導を試みたところ、アルブミンの発現が確認できた。障害肝ラットへの移植実験でも、SP細胞が肝細胞に分化する可能性が示唆された。しかし、移植細胞の生着とアルブミン発現を確認できたものの、生存率や肝機能の改善は認められなかった。
現在我々は、幹細胞を、in vitroで肝細胞へ分化誘導してから移植するほうが、効率がいいのではないかと考え検討を行っている。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】42,770千円 (直接経費: 32,900千円、間接経費: 9,870千円)