【研究領域課題番号】18K05829 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

海洋性プランクトン / 棘皮動物 / イトマキヒトデ / サイズ依存性 / 発生シフト / TGFb / アポトーシス / アスタチン族メタロプロテアーゼ / 消化システム / ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体 / 神経システム / 温度感受性チャネル / 神経ネットワークの崩壊 / 海洋プランクトン / ヒトデ / 摂餌 / 成長 / 神経 / メタロプロテアーゼ / ヒストン / ヒトデ幼生 / 凝縮 / サイズ / 神経回路 / プランクトン幼生 / 栄養循環 / 神経系 / マリンバイオロジー

【研究成果の概要】

本研究の目的は、棘皮動物ヒトデ幼生の消化システムと神経システムに焦点を当てながら、成長に寄与する消化・吸収ならびに栄養素の伝搬・受容を理解することにある。本年度もコロナ禍による研究制限の状態が続いたが、複数の重要な研究データを得ることができた。その一部を用いて、学会発表を行った。
消化システムと神経システムの解明ポイントとなる幼生サイズの増加に着目した結果、胚期の時間依存的な発生様式と異なり、幼生サイズに依存した成長が進行して変態可能なステージに移行することを明らかにできた。この過程で摂餌は必要であり、（１）餌がない状態では変態可能になる前段階で形態形成が停止すること、（２）摂餌には感覚神経細胞が重要な働きをしていることも判明した。
一方、幼生成長の基盤をなす上皮細胞数の確保において、上皮細胞増殖の主因となる間充織細胞の膜型アスタチン属メタロプロテアーゼ（MC５分子）は、TGFbの潜在型から活性型への変換だけでなく、上皮細胞の生存自体をも担保している可能性を見出した。このとき、上皮細胞の生存に対するデフォルトの表現型は、細胞断片化によるアポトーシス細胞死である証拠も得られた。最終年では、既得したデータ解析や論文の補助的データ取得を含みつつ、研究の完成を目指す。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】腫瘍生物学

【研究領域課題番号】24501311 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

FAIRE-seq / シグナル伝達 / EMT / 乳がん / TGF-beta / ZEB1 / アポトーシス / ゲノム / 癌 / 転写因子 / lncRNA / lincRNA / FAIRE / RNA-seq / オープンクロマチン / TGF-β

【研究成果の概要】

本研究では乳腺上皮細胞の上皮間葉転換EMTにおける遺伝子発現変化を次世代シーケンサーを用いたRNA-seqにより解析するとともに、オープンクロマチン領域の変化につきFAIRE-seqを用いてデータ取得を行った。その結果発現変動を受けるnon coding RNAなどの新規転写産物を同定した。このうちlncRNA-Smad7の抗アポトーシス作用を見いだした。また乳腺上皮細胞に恒常活性RASを発現させTGF-βによりEMTを起こす細胞ではオープンクロマチン領域に違いが生じることを見出した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】20249064 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

骨 / 軟骨 / 筋 / 神経 / Bcl-2ファミリー / Bcl-xL / 破骨細胞 / TGF-beta / Cbl-b / RANTES / VICOM / Oligodendrocyte / 運動器 / 筋細胞 / アポトーシス / c-Src / Bc1-2 / RFN10 / apoptosis

【研究成果の概要】

「運動器」は動物の生命維持に必要不可欠な活動である「運動」を担う器官の総称であり、骨、軟骨および筋組織など直接運動に関与する組織、さらにはこれらの働きを調節制御する神経組織をも網羅する概念である。本研究では運動器を担う骨、軟骨、筋、神経の機能制御メカニズムをアポトーシス調節分子であるBcl-2ファミリー分子の役割を中心に解析した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2008 - 2011

【配分額】46,540千円 (直接経費: 35,800千円、間接経費: 10,740千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】17390089 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / RNA結合蛋白質 / KHドメイン / p53 / TGF-beta / エストロジェン / TPA / splicing / D8 / TGF-b / Bim / 3'-UTR / ノックアウトマウス / PNA

【研究成果の概要】

新規PNA結合蛋白質D8がアポトーシスを誘導する活性をもつことを見出しその分子機構を解析した。
1)D8はDNAストレスによるアポトーシズの誘導に重要な役割を果たしていることを見出した。
2)ルシフェラーゼ・アッセイ、クロマチン免疫沈降法によりD8のプロモーターがp53やTGF-betaシグナルにより直接に転写活性化されることを明らかにした。
3)D8がアポトーシスを誘導するためには、RNA結合活性をもつKHドメイン1,2両方が必要であった。
4)Bimの誘導がD8によるアポトーシス誘導に重要であることを明らかにした。
5)D8にエストロジェン受容体が結合し、mRNAのsplicingに関与することを示唆する結果を得た。
6)D8以外に染色体1,18,19に存在するファミリーを同定し、TPAによって発現誘導されることを見出した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】15390100 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA結合蛋白質 / p53 / TGF-β / アポトーシス / Bim / KHドメイン / 標的遺伝子 / ノックアウトマウス / TPA / 発現誘導

【研究成果の概要】

p53およびTGF-βによって発現誘導される新規遺伝子D8を見出し、以下の事実を明らかにした。
1)D8をHepG2などの癌細胞に強制発現するとアポトーシスを誘導する。RNAiを用いてD8の発現を抑制するとp53やTGF-βによるアポトーシスの誘導が阻害される。これらの結果から、D8はp53やTGF-βによるアポトーシスの誘導に重要な役割を果たしていると考えられた。
2)5FU、アドリアマイシンなどによりゲノムの損傷をうけるとD8の発現が増加すること、これらの薬剤によるアポトーシスにD8が重要な役割をはたしていることを見出した。
3)BH3 onlyファミリーに属すBimがD8のKHドメインに結合することを見出した。RNAiを用いてBimの発現を抑制するとD8によるアポトーシス誘導が阻害されることから、BimはD8によるアポトーシス誘導に重要な役割を果たしていると考えられた。
4)D8はアポトーシスを誘導する活性のあるBimのmRNAを安定化することによりアポトーシスを誘導していると考えられた。
5)D8ノックアウトマウスの作成を進めた。
6)D8と相同性が高くドメイン構造も類似した3種類のタンパク質をコードする遺伝子(D8-2、D8-3およびD8-4)が存在し、D8ファミリーを構成していることを見出した。D8ファミリーの各cDNA全長を単離し全構造を明らかにし、ノックアウトマウスの作製を進めた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】15,400千円 (直接経費: 15,400千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09480199 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / 骨形成因子 / 癌抑制遺伝子 / シグナル伝達 / 増殖抑制 / Smad / セリン・スレオニンキナーゼ / 遺伝子ターゲッテイング / レセプター / アクチビン / アポトーシス

【研究成果の概要】

1. Tkv結合蛋白質クローニングとその哺乳類細胞での機能解析:ショウジョウバエのセリン-スレオニンキナーゼ型レセプターであるThick veins(Tkv)に結合する蛋白質をtwo-hybrid法で検索し、DIAP1(Drosophila apoptosis inhibitor-1)をクローニングした。
2. Smadのシグナル伝達機構における役割:我々はSmadファミリーの分子をその構造と働きから、特異型、共有型、抑制型の3種類に分類できることを明らかにした。また新しいSmad分子であるSmad6をクローニングした。Smad6は他のSmadの作用を抑制する抑制型Smadであることが明らかとなった。
3. 骨形成因子のシグナル伝達におけるSmadの役割と遺伝子導入による解析:アデノウイルスベクターに組み込んだSmad1やSmad5を骨芽細胞前駆細胞に導入してその作用を調べた。Smad1やSmad5は単独で細胞に感染させても骨芽細胞への分化誘導活性は低いが、低濃度のBMPや活性化型レセプターを加えると、作用の劇的な増強が見られた。
4. TGF-βシグナルに関与するSmad3の変異体の機能解析と腫瘍形成能:Smad3の407番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異を作り、その作用を検討した。変異型Smad3はTGF-βのシグナルを伝達しないだけでなく、優勢抑制型変異体として作用した。変異型Smad3を大量に発現している細胞ではTGF-βの増殖抑制作用に対し抵抗性になっていた。さらにこれらの細胞をコラーゲンゲルの上で3次元培養するとコラーゲンゲルの中に細胞が浸潤していく像が見られた。
5. シグナル伝達分子の遺伝子ターゲッテイング:BMPレセプターII型遺伝子およびSmad2のターゲッテイングを行った。いずれも発生初期の段階で致死的であった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】15,100千円 (直接経費: 15,100千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】09044334 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TCR / FasL / TGF-β / STAT / Smad / SSl-1 / Src / CD40 / Lyn / アポトーシス

【研究成果の概要】

以下に各研究者のグループにおいて得られた成果の概要を記す。免疫細胞の機能とその分化に関連し、笹月らはT細胞の胸腺内分化において、特にT細胞のポジティブ選択に、特異的なTCR-ペプチドの相互作用が存在することを明らかにした。奥村は免疫反応のエフェクター相に関与する分子群の研究を進め、キラー細胞の有するFasLは、人工的に他の細胞に発現させた場合、今まで知られていなかった炎症惹起効果があることを明らかにした。岸本らは、シグナル伝達物質STATの活性化抑制分子SSl-1のクローニングを通し、サイトカイン刺激後の細胞内シグナル制御機構を明らかにした。菊谷は、CD40-CD40Lの相互作用の重要性を自己免疫発症モデルを確立することによって明らかにした。宮園は、TGF-βのリンパ球増殖抑制シグナルの研究を進め関連シグナル伝達分子Smadの働きを明らかにした。渡邊はリンパ球の増殖分化・死に関するシグナル伝達分子Srcファミリーチロシンキナーゼの一つLynキナーゼ欠損マウスを確立し、そのマウスの自己免疫現象との連りを明らかにした。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1997

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】08457495 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / TGF-βスーパーファミリー / GDF / BMP / セリン / スレオニンキナーゼ型受容体 / シグナル伝達 / アポトーシス

【研究成果の概要】

TGF-βスーパーファミリー遺伝子群は、個体発生ならびに癌化との関わりが、最近特に注目されている。しかしながら、30種類近くあるTGF-βスーパーファミリーリガンドとTGF-βスーパーファミリー受容体の間では、必ずしも1対1の相対関係が成立せず、複数のリガンドが異なる親和性をもって受容体を共有していることが知られている。このことは、TGF-βスーパーファミリーの多様な作用のメカニズムを解明する上で重要なポイントと考えられ、われわれは、本研究において、TGF-βスーパーファミリーにおけるリガンド受容体の明確な対応関係を明らかにすることならびにシグナル伝達経路を解明することを大きな目的として研究を行った結果、以下に示す成果を得た。1)新規セリン/スレオニンキナーゼ型受容体ならびに種々のタイプII受容体を、様々な組み合わせでCOS細胞に共発現させ、TGF-βスーパーファミリーリガンドとの結合能を、親和性架橋結合法ならびに非標識リガンドを用いた定量的結合検定法にて解析することにより、新たにBMPファミリーに属するGDF-5の受容体を同定した。2)TGF-βtype I受容体細胞内領域に変異導入を行うことにより、TGF-βの増殖抑制シグナルとマトリックス誘導シグナル伝達経路を分離しえた。3)BMPにより特異的に発現が誘導される遺伝子を同定するために未分化間葉系細胞を用い、differential display法を行なった結果、新規シグナル伝達分子、BORG(BMP/OP-responsive gene)のクローニングに至った。4)新規セリン/スレオニンキナーゼ、ASK1の解析を進めた結果、ASKIが、TNFや、様々なストレスによって誘導されるアポトーシスのシグナル伝達分子のひとつであることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996

【配分額】6,300千円 (直接経費: 6,300千円)

【研究分野】応用獣医学

【研究領域課題番号】07456141 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分化誘導 / 犬骨肉腫細胞 / ビタミンD / TGF-β / BMP-2 / ALP活性 / オステオカルシン / レチノール / 骨肉腫細胞 / ビタミンD_3 / TGF-β_1 / 抗腫瘍剤感受性 / 放射線感受性 / 転移能 / 分化誘導療法 / 骨肉腫細胞株 / I型コラーゲン / アポトーシス

【研究成果の概要】

本研究の目的は、小動物の転移好発性の悪性固形腫瘍に対し、腫瘍殺滅を主体とする副作用を伴う従来の治療法に代わり、腫瘍自体の悪性度を人為的にコントロールする分化誘導療法が治療法となりうるか否かを追及することにある.
第一に、このような腫瘍に対する従来の治療成績をまとめ、総説としてその一部を発表したが、これは日本におけるデータがほとんどなかったためであり、その結果、諸外国で報告されている成績とほぼ同様であることが明らかとなった.同時に、これらの腫瘍から細胞株の樹立を試み、すでに骨肉種、肥満細胞種、乳腺癌など、多くの腫瘍細胞を樹立した(骨肉種-既発表および掲載予定、肥満細胞種-投稿準備中、乳腺癌-投稿準備中).これらはいずれももともとの組織と高い相同性を有しており、今後この分野の研究だけでなく、腫瘍研究に広く用いられるものと考えられる.
最も初期に樹立した犬の骨肉腫細胞に対し、ビタミンD3、TGF-β、BMP-2といった生理活性物質を用いてin vitroでの分化誘導を試みた.その結果、これらの物質は程度の差はあるものの、骨芽細胞の指標となるALP活性、オステオカルシン濃度、PTH応答性cyclic-AMP濃度、I型コラーゲンなどをいずれも増加させた.また、電顕所見等から、これらの物質による分化誘導はアポトーシスを介して生じることが示唆された.
一方、より分化した細胞ほど抗ガン剤、放射線に感受性を示すが、これらの物質によって分化誘導された細胞はいずれもこれらの治療法に対する感受性を増加させた.これらの結果は、きわめて悪性度が高い骨肉腫がin vitroではあるが、これらの生理活性物質によって分化が亢進する可能性を示唆しており、今回の研究ではできなかったが、in vivoの系、あるいは実際の症例を用いて検討する価値があると考えられた.
現在、新たに2種の骨肉腫細胞を用いて、最近注目されているレチノール系薬物による分化誘導を検討しており、すでに良好な結果が得られ、今春に学会発表予定である.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)

【研究分野】病体医化学

【研究領域課題番号】07557334 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TGF-β / レセプター / 癌抑制遺伝子 / シグナル伝達 / 増殖抑制 / Smad / セリン・スレオニンキナーゼ / アポトーシス / セリン-スレオニン・キナーゼ / アクチビン / 免疫抑制剤 / cDNAクローニング / セリン-スレオニンキナーゼ

【研究成果の概要】

β型トランスフォーミング増殖因子(TGF-β)は細胞の増殖を抑制するほか多彩な作用をもった生理活性物質である。TGF-βは二種類のセリン-スレオニンキナーゼ型レセプター(I型、II型)によってシグナルを伝達し、細胞内ではSmadという蛋白質を介してシグナルを伝達する。本研究では以下のプロジェクトについて研究を行った。
1)TGF-βI、II型レセプターの種々の疾患における発現:網膜芽細胞腫や扁平上皮癌、前立腺癌などを中心にレセプターの発現と変異の有無を検討した。網膜芽細胞腫の培養細胞株ではII型レセプターの発現を認めないが、分化にともない発現が見られた。II型レセプターのプロモーター領域には変異は見られなかった。またI型レセプターにも異常があることが示唆されたが、Smadには異常は見られなかった。前立腺癌でもI、II型レセプターの発現の低下を認めた。
2)TGF-βレセプターの細胞内基質の同定とcDNAクローニング:酵母を用いたtwohybrid法により、ショウジョウバエのI型レセプターThick veinsの基質となるペプチドしてDIAP1(Drosophila inhibitor of apoptosis-1)をクローニングした。
3)シグナル伝達分子Smadの作用と疾患における異常の検討:TGF-βレセプターのシグナル伝達分子Smad2の異常を同定するため、遺伝子構造の決定を行った。さらにSmad2にはエクソン3が転写されないタイプのものが存在することを明かにした。エクソン3のないSmad2はこれをもつものよりも活性が高い可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】7,900千円 (直接経費: 7,900千円)