Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

ハイドロキシアパタイト / 脊椎固定術 / 幹細胞 / 骨再生 / rhBMP-2 / ラット / ヌードマウス / 培養骨 / 骨芽細胞 / BMP

平成14年でのMC3-T3細胞、骨髄細胞を用いたin vitro実験の結果、ハイドロキシアパタイトファイバーシート(HAシート)は、気孔率、気孔径の調節が自在にでき、細胞の三次元培養が可能であると同時に、その高い生体親和性から、蛋白の担体としても利用可能と考えられる.平成14年度に作製した、ラット脊椎固定術モデルを用いて、平成15年度は、(1)recombinant human bone morphogenetic protein-2(rhBMP-2)を付加したHAシートをrhBMP-2のcarrierとして利用し、脊椎固定術に応用可能か(2)骨芽細胞を内部で培養したHAシートが骨再生のscaffoldとして利用可能か、移植実験動物モデルへの移植を行い評価した.実験(1):ラット脊椎固定術モデルに対し,異なる量のrhBMP-2(5,10,15μg)を付加したHAシートを移植骨として用い、第5〜6腰椎間両側後側方固定術を施行した.術後腰椎を一塊として摘出,骨癒合の有無を評価した.実験(2):1日齢ラット頭蓋骨由来の骨芽細胞様細胞を培養シャーレで培養後、トリプシン処理で細胞懸濁液を作成した.これを気孔率と気孔径が95%、5μm(SO)、99%、250μm(S2000)の2種類のHAシートに5×10^6個の細胞数で播種し、2週間培養した.それらをヌードマウス皮下に移植し、1〜4週目に試料を摘出、光顕による観察を行った.実験結果(1):10,15μg付加群の全例で移植後4週以内に骨癒合を得た.実験結果(2):移植後早期には、S2000のほうがより多くの細胞がシート内部に三次元的に付着、増殖していた.しかし移植後4週目以降は、S2000では元の約半分の大きさに縮小、内部の細胞も減少したが、力学的強度で勝るSOでは内部に軟骨細胞様細胞が充満し、旺盛な内軟骨性骨化を認めた.よってHAシートは、骨再生における骨芽細胞のscaffoldとしても使用可能であるだけでなく、rhBMP-2の担体として有用であり、脊椎固定術へも応用可能と考えられた.

LIF / 心筋梗塞 / プラスミド / 心臓リモデリング / VEGF / GFP / 骨格筋 / 共培養 / アポトーシス / 血管新生 / 骨髄細胞 / 遺伝子治療 / 幹細胞 / 心筋細胞 / 骨格筋細胞 / ANP / GATA / 心不全 / 心筋細胞分化 / BMP / TAK / Smad / ATF-2

leukemia inhibitory factor(LIF)の心臓に対する作用をマウスの心筋梗塞モデルを用いて検討した。心筋梗塞後のマウスの下肢にLIFのプラスミドを筋肉内注射したところ、2日後より血液中のLIF濃度は増加し、その後4週間後まで持続した。心筋梗塞を作成してから2週間後に心臓を評価した。LIFプラスミド注射群(LIF群)ではコントロール群に比べ、心筋梗塞後の心機能の低下や心臓リモデリングは軽減していた。梗塞境界領域での心筋細胞のアポトーシス数もコントロール群に比べLIF群で減少していた。LIF群ではVEGFの発現の亢進と血管内皮細胞の増加が認められたことより、LIFによる血管新生が心筋細胞のアポトーシスを減少させている可能性が示唆された。増殖している細胞の核で発現するKi-67蛋白の抗体で免疫染色をおこなったところ、LIF群では梗塞境界領域でKi-67陽性の心筋細胞が認められた。次にGFPトランスジェニックマウスの骨髄細胞を野生型マウスに移植し心筋梗塞を作成して解析をおこなった。LIF群ではコントロール群に比べ2週間後の梗塞境界領域におけるGFP陽性細胞数が増加していた。さらにこのGFP陽性細胞が心筋細胞や血管内皮細胞であることを確認した。今回の研究でウイルスベクターを使わなくとも、プラスミドの筋肉内注射のみで有効な治療効果が得られることも明らかとなった。
骨格筋内に心筋細胞へ分化可能な細胞が存在するか否かを検討するため、GFPを過剰発現するマウスの骨格筋由来細胞を単離し、1)新生仔ラットの心筋細胞と共培養、2)骨格筋由来細胞の単独培養、3)心筋細胞と培養液のみ共有するdouble chamber法による共培養、の3通りの方法で培養した。培養5日後に免疫細胞染色法により心筋特異的トロポニン、ANP、GATA4、cadherin、connexin43の発現を比較検討した。その結果、両者の細胞が互いに接することが可能な共培養下においてのみGFP陽性細胞の一部にトロポニン、ANP、GATA4の発現が認められた。また骨格筋由来細胞と心筋細胞との細胞間接着部位にcadherinとconnexin43の発現が認められた。これらの結果から骨格筋内に心筋細胞に分化可能な細胞が存在することが明らかになった。

【研究分担者】
相澤守	明治大学	理工学部	助教授	(Kakenデータベース)

【研究分担者】
廣井透雄	東京大学	医学部付属病院	助手	(Kakenデータベース)