【研究分野】皮膚科学

【研究領域課題番号】14370262 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

細胞接着 / デスモグレイン / カドヘリン / ケラチン / 天疱瘡 / 自己抗体 / アデノウイルス / 細胞骨格

【研究成果の概要】

本研究では、蛍光蛋白質を用いて、表皮細胞間接着において重要な役割をするデスモゾーム関連蛋白のリアルタイムイメージング法を開発するとともに、天疱瘡における抗デスモグレイン3(Dsg3)IgG自己抗体反応後の細胞間接着におけるそれぞれの蛋白の空間的情報(細胞内局在)及び時間的情報(経時変化)を解析し、全く新しい観点からデスモゾーム関連蛋白の機能解析を行った。GFP融合ケラチン14をアデノウイルス発現系を用いて正常ヒト表皮角化細胞(NHEK細胞)に遺伝子導入したところ、導入したケラチン線維は角化細胞内で網状の構造を示すと共に、培養液中のCa濃度を上昇させることで接着面へのinsertionが見られることが明らかとなった。また角化細胞に抗Dsg3 IgG抗体を反応させたところ、角化細胞同士の接着障害が見られると共に、Dsg3の細胞内へのinternalizationおよびケラチン線維の細胞膜からのretractionが生じることが、経時的固定後の観察ならびにデルタヴィジョンを用いたリアルタイムイメージング法の両方により明らかとなった。また角化細胞における接着障害能の異なる抗Dsg3 IgG抗体を角化細胞に反応させた際、Dsg3とケラチンの挙動に違いが見られることを細胞レベルで明らかにした。本研究の成果は、天疱瘡における水疱形成機序を分子レベルで解明する上での新しい所見を得るのみならず、表皮細胞間接着の分子機構についても新しい視点を導入するものと考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】13,400千円 (直接経費: 13,400千円)

【研究分野】皮膚科学

【研究領域課題番号】12770455 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自己免疫 / 自己抗体 / B細胞 / 天疱瘡 / ELISPOT法 / デスモグレイン / 細胞接着 / カドヘリン

【研究成果の概要】

本研究では、天疱瘡における自己抗体を産生するB細胞を検出する方法を組換え天疱瘡抗原を用いたELISPOT法により確立することを目的とする。末梢血中に存在する天疱瘡抗原特異的B細胞の数が、病勢と相関するか検討し、B細胞を標的とした治療法の開発の基礎的データとする。さらに、自己抗体産生におけるT細胞、B細胞の相互作用を検討するために、in vitroにおける自己抗体産生系を構築することを目的とする。昨年度までは、尋常性天疱瘡抗原(Dsg3)に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を陽性細胞として用いて、組換えDsg3を抗原としたELISPOTによる検出系を確立した。さらに、組換えDsg3にて免疫したマウスの脾臓、リンパ節、骨髄および、末梢血から単核球を分離し、Dsg3組換え抗原蛋白を用いたELISPOT法により、各臓器中に含まれるDsg3特異的抗体を産生するB細胞の算定した。また、我々の開発した天疱瘡モデルマウスにおける抗体産生細胞をELISPOT法により検出し、経時的変化を検討した。本年度は天疱瘡患者末梢血より分離された単核球を組み換えDsg3蛋白とマイトジェンにて刺激後ELISPOT法を行うことによりメモリーDsg3特異的B細胞を検出し、in vitro抗体産生系を開発した。このin vitro抗体産生系はT・B細胞の相互作用の解析などにも有用であると考えられた。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】皮膚科学

【研究領域課題番号】09670895 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自己免疫性疾患 / 天疱瘡 / ELISA / 診断薬 / 病勢モニタリング / カドヘリン / デスモグレイン / 細胞接着

【研究成果の概要】

本研究の目的は、我々の開発したELISAにより得られる抗体価(ELISAスコア)と病勢との相関関係を検討し、ELISAスコアが病勢をモニターする指標となりうるかを検討することである。平成9年度には、組換え蛋白(rDsg3,rDsg1)を抗原としたELISA法を実際の日常診療で使用可能である実用性の高いものとした。陽性および陰性コントロールを用いてELISAスコア(Index値)を以下の如く簡便に計算出来るようにした。Index値=(患者血清のODー陰性コントロールのOD)/(標準血清のODー陰性コントロールのOD)X100。Index値が、20以上を確実陽性、10-20をグレーゾーン、10以下を陰性とする判定基準を設けた。さらに血清学的診断基準を決定した。すなわち、Dsg3陽性であれば、Dsg1の反応性に関わらず、診断はPVであり、Dsg1陽性であり、Dsg3陰性であれば、診断はPFである。平成10年度には、選出された症例の血清をELISA法にて抗体価を測定し、病勢と相関関係を検討した。PV,PFともに、Dsg3,Dsg1を抗原としたELISA法にて得られる抗体価は、病勢と強い相関性を示し、本ELISA法が病勢のモニタリングとして使用できることが結論された。さらに、Dsg3とDsg1の種々の領域を含むキメラ蛋白をバキュロウイルス発現系にて作製した。それらのキメラ蛋白との競合ELISAを施行したところ、Dsg1、Dsg3ともN末1/3の領域に主要エピトープが存在することを示した。また、少数例においては、細胞外領域中央部1/3の領域にエピトープを有する症例が認められた。これは、天疱瘡抗原における3次元エピトープを初めて明らかにしたことになる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】皮膚科学

【研究領域課題番号】09557064 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自己免疫性疾患 / 天疱瘡 / B細胞 / 疾患特異的治療法 / 組換え毒素 / カドヘリン / デスモグレイン / 細胞接着

【研究成果の概要】

本研究の目的は、より疾患特異性の高い副作用の少ない自己免疫性疾患に対する新しい治療法の開発を目指し、患者血中を循環する自己抗体を産生するB細胞に照準を当て、正常なB細胞を破壊することなく病的なB細胞のみを破壊する選択的除去法を開発する事である。対象疾患は、表皮接着分子であるデスモグレイン3(Dsg3)に対する自己抗体が産生される尋常性天瘡である。平成9年度は、治療法の効果判定に必要な疾患モデルをマウスを用いて作成した。天庖瘡抗原本来の立体構造を正しく反映した組換え抗原蛋白(rDsg3)をマウスに免疫し、デスモグレインに対する自己抗体の誘導を試みた。免疫後、rDsg3を抗原として用いた組換え抗原蛋白に対する抗体の産生能をELISA法にて検討したところ、免疫後3週から4週にて抗体価の上昇を認めた。平成10年度は、Dsg3の細胞外領域と毒素とのキメラ分子(組換え毒素)を作製した。自己抗体産生B細胞の膜表面にはDsg3に対するイムノグロブリン受容体が発現されており、組換え毒素はDsg3部分がリガンドとなり抗原特異的にB細胞を認識できる。毒素は、Pseudomonas Exotoxin(PE40)を用いた。発現系として、PE40は真核細胞に対して毒性を持つため、大腸菌の発現系を用いた。また、可溶性を増すために、N末にはthioredoxin(TRX)を挿入した。Dsg3は、主要エピトープを含むN末1/3の相当するEC1およびEC2の約半分の領域を含むものを使用した(Dsg3DN1)。組換え毒素は、TRX-Dsg3DN1-PE40として発現させたものを、トロンビン処理によりTRXを除き、Dsg3DN1-PE40とした。Dsg3に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ならびに平成9年度に作製した天庖瘡マウスの脾細胞を標的細胞として、毒素活性を検討したところ、抗原特異的に約60%の細胞を除去することに成功した。本研究の成果は、抗原特異的B細胞破壊法の実用化に向けて大きく一歩前進したことになる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】12,100千円 (直接経費: 12,100千円)

【研究分野】皮膚科学

【研究領域課題番号】08457236 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ケラチノサイト / 細胞接着 / 細胞内情報伝達 / 尋常性乾癬 / 天疱瘡 / デスモヨ-キン / デスモグレイン / エンボプラキン / デスモソーム / 炎症 / 増殖 / 表皮 / 分子生物学 / デスモコリン

【研究成果の概要】

昨年に引き続き、デスモヨ-キン(DY)の細胞膜および核内への移行に関与する分子内部位を明らかにする目的で、そのN末端・中央部・C末端部のcDNAを組み込んだ有核細胞発現系ベクター(pcDNAI/Amp)のconstractを用い、今回はMDCK細胞および正常ケラチノサイトにtransfectした。その結果、DYのN末端および中央部は細胞質内に分布し細胞膜および核内への移行は見られなかったが、C末端部には核内および細胞膜部両方への移行が見られた。これはDYのC末端部が細胞接着と細胞内情報伝達の両方に重要な機能を有していることを示したものといえる。さらに、私共は、各種の免疫学的・生化学的手法を用いた検索で、ごく最近新しく発見されたデスモソーム蛋白で、cornified envelopeとの結合に関与していると考えられている、エンボプラキンおよびペリプラキンが、新しい疾患概念である腫瘍随伴性天庖瘡の抗原であることを証明した。これらの蛋白は表皮ケラチノサイトの細胞接着および分化に重要な役割を果たしていると考えられる今後、尋常性乾癬、有棘細胞癌、扁平苔癬などの多くの炎症性・増殖性皮膚疾患の発症における関与の可能性について検討する予定である。一方、デスモソーム細胞接着蛋白としては、各種デスモグレイン(Dsg)が様々な水疱症の抗原となりうること、特に腫瘍随伴性天疱瘡の抗原のひとつでもある可能性を示唆した。さらに、もう一種のデスモソーム細胞接着蛋白であるデスモコリン(Dsc)の皮膚疾患における重要性はいまだ報告がなかったが、今回、Dsc1が新しい疾患概念であるIgA天疱瘡(SPD型)の自己抗原であることを証明した。これは、この疾患には著明な膿疱形成が見られることより、Dscが細胞接着だけではなく好中球の遊走など各種炎症にも関与していることを示唆した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】7,400千円 (直接経費: 7,400千円)

【研究分野】皮膚科学

【研究領域課題番号】04454289 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

天疱瘡 / デスモソーム / カドヘリン / デスモグレイン / 分子生物学 / cDNA / 複合蛋白 / ウエスタンブロット / 自己抗原 / 遺伝子工学 / デスモコリン / 尋常性天疱瘡抗原 / 細胞接着

【研究成果の概要】

現在、デスモソームカドヘリンとして落葉状天疱瘡(PF)抗原であるデスモグレイン(DG)、ドスモコリン(DC)および尋常性天疱瘡(PV)抗原が知られている。初年度、私共はDCおよびDGのcDNAを用いて作成した大腸菌リコンビナント蛋白による研究により、DCが新しい天疱瘡抗原となり得る可能性を示し、さらにPF血清が主としてDGの細胞外部位に反応するのに対して、PV血清はDGの細胞内部位に反応することを示した。第2年度はまず、種々の天疱瘡患者の診断ないし病態の解明にこれらの研究を応用し、一部の患者では上記三種の抗原に対する抗体が共存すること、さらに、PVからPFに移行する症例があることを明らかにした。また、一部の臨床的には天疱瘡の症状を示さない患者にDGの細胞質内部位に対する抗体が存在することを示し、この抗体は病原性がないものと考えた。これらの研究は天疱瘡の病変発症の機序の解明に重要なものと考えた。さらに、私共は現在知られている三種のDCのcDNAを用いて大腸菌リコンビナント蛋白を作成し、IgGおよびIgAの抗DC抗体は少なくとも二種以上の異なったDC分子に反応することを示した。さらに、より自然に近い形のPV抗原を得るため、PV抗原cDNAをBaculovirus発現ベクターに組み込み、昆虫有核細胞に発現させたリコンビナント蛋白を作成した。この蛋白には、ほとんどすべてのPV血清が反応したことより、自然に近い形状を有していると考えられた。さらに、現在PV血清中のIgGを新生マウスに投与することにより病変を形成させることができることが知られているが、このリコンビナント蛋白によって吸収した血清IgGでは病変形成が生じなかった。このことは将来この蛋白を用いたカラムによる血漿交換療法により効率的に患者血中抗体を取り除くという最新の治療法の可能性を示したものと言える。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1992 - 1993

【配分額】6,800千円 (直接経費: 6,800千円)