【研究領域課題番号】21KK0199 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

温度応答性高分子 / 機能性界面 / バイオ界面 / 細胞組織 / 幹細胞 / 再生医療 / 組織工学

【研究成果の概要】

本研究は、米国ユタ大学との国際共同研究により、再生医療に用いる幹細胞組織を作製するための機能性バイオ界面を開発することを目的としている。
令和三年度は、温度応答性高分子であるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)を細胞培養皿表面に修飾して作製した機能性バイオ界面、および、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミドと細胞非接着領域として親水性のポリアクリルアミドをラインパターン状に修飾して作製した機能性バイオ界面を作製した。
作製した機能性バイオ界面を用いて、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の細胞組織の検討を行った。ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)のみを修飾した機能性バイオ界面では、タンパク質コーティングの量や、細胞播種密度を調節することで、間葉系幹細胞組織を作製することができた。
また、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)とポリアクリルアミドをライン状にパターニングして作製した機能性バイオ界面では、幹細胞が配向して組織化されることが確認できた。また、三種類の間葉系幹細胞の比較では、骨髄由来間葉系幹細胞は配向しやすく、臍帯由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞は配向しにくい傾向が確認された。そこで、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)とポリアクリルアミドのラインパターンの間隔や、ポリアクリルアミドの修飾量を制御することで、臍帯由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞の配向性を確認することができた。

【研究種目】国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))

【研究期間】2021-10-07 - 2025-03-31

【配分額】19,110千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 4,410千円)

【研究領域課題番号】18K19592 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脱細胞化 / 臓器再生 / 胆管再生 / 肝臓移植 / 細胞外マトリックス / 胆管上皮細胞 / 幹細胞 / 臓器不全 / 組織工学

【研究成果の概要】

肝臓の再生機序を理解する上で、立体的な胆管構造と胆汁の産生・排泄機能の再構築は必須の課題であるが、複雑な三次元構造と細胞同士の相互関係を復元することは非常に困難である。我々は脱細胞化肝臓骨格内の立体構造を利用することで胆管の再生を目指した研究を進めてきた。本研究成果によって、脱細胞化骨格が持つ立体構造を利用することで、これまで困難であった三次元胆管構造の再生への道筋が示された。また成熟細胞はもとより、肝前駆細胞単独での機能的胆管再生の可能性が示唆された。

【研究の社会的意義】

本研究はこれまで肝臓再生研究の最大の障壁となっていた「胆汁産生と排泄」機能をもった肝臓を、ヒトiPS細胞とブタ由来の臓器骨格を用いることで実現化しようとする非常に挑戦的な研究である。本研究成果は、世界初の胆汁産生を伴う肝臓再生の実現化はもちろん、今後の臓器再生における極めて斬新な研究ツールへの発展、あるいは体内における肝再生の新たな基礎的知見の創出に繋がり、最終的にヒトiPS細胞を用いた再生肝臓が創出されれば、今後の医療を大きく変える代替臓器開発に大きな布石となり得る。

【研究種目】挑戦的研究(萌芽)

【研究期間】2018-06-29 - 2021-03-31

【配分額】6,370千円 (直接経費: 4,900千円、間接経費: 1,470千円)

【研究分野】小児外科学

【研究領域課題番号】16H02682 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 再生医療 / 腸管蠕動不全 / 移植・再生医療 / 再生医学 / 細胞・組織 / 歯学 / 小児外科学 / 再生医療学 / 乳歯幹細胞学 / 細胞移植 / 組織工学 / 指定難病 / ヒルシュスプルング病 / ヒルシュスプルング病類縁疾患 / 乳歯幹細胞

【研究成果の概要】

上記疾患群の中で予後不良である腸管神経節細胞僅少症(HYPO)に、第一にfocusをした。HYPOは腸管神経節細胞は存在するがその数が極めて少ない特徴を有す。同じく腸管神経細胞の減少を認めるマウス(JF1)を用いて、健常児由来の乳歯幹細胞(SHED)を投与した。結果、体重増加を得、その有効性を証明した。次に、HYPO患者由来のSHED(HYPO-SHED)の解析を行った。SHEDは間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)であるが、HYPO-SHEDは、MSCに矛盾しない表現型を有していること、ならびに増殖能や造腫瘍性に関する解析を行った。

【研究の社会的意義】

SHEDはiPS細胞と比較し遺伝子導入が不要、作成効率が概ね100%、高い自己再生能、HLAの発現が低く拒絶を受けない点で優れ、さらに低侵襲かつ容易に採取可能である。また、歯髄の状態で凍結保存が可能であるため乳歯幹細胞のバンクをつくることができる。本基盤研究にて、健常児由来SHEDにおけるhypoに対する治療メカニズム・治療効果を詳細に解明した上で、hypo-SHEDの細胞の特性の解析に移行し、自家細胞移植の可能性を模索し、バンク化も目指す乳歯保存の基盤づくりを行った。このように実臨床における治療を視野に自家他家移植いずれも実現することを目標とできた本研究は大きな学術的、社会的意義を有する。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2016-04-01 - 2020-03-31

【配分額】47,450千円 (直接経費: 36,500千円、間接経費: 10,950千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】25670706 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮再生 / 子宮再建 / 組織工学 / 幹細胞 / 脱細胞化 / 再細胞化

【研究成果の概要】

ラットを用いて脱細胞化・再細胞化による子宮再建技術の開発を行った。その結果、界面活性剤を用いることで、細胞外マトリックスや微小血管構造骨格を維持したままラット子宮から細胞を除去する（脱細胞化）技術を開発した。また、この脱細胞化骨格に、子宮細胞などを注入することにより、子宮様組織を再構築し得た（再細胞化）。さらに、in vivoでの再細胞化として, ラット子宮の一部を切除して脱細胞化マトリックスに置換した結果、プロゲステロン受容体や脱落膜化マーカーの発現を伴う子宮組織が再生されただけでなく、この子宮において自然妊娠が成立した。本法がヒト子宮再建に向けての有用な基盤技術になる可能性が示唆された。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2013-04-01 - 2015-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】24791392 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 乳房再建 / 細胞移植 / 組織工学 / 間葉系幹細胞 / 生体医工学

【研究成果の概要】

本研究ではヒト間葉系幹細胞を用い、細胞移植後の生着の土台として生体吸収性ハイドロジェルで補助した上で、細胞移植を行い、その対象としてマウスの乳房原基とされるMammary Fat Padという組織を部分切除し、実際の臨床で見られる乳房切除と近似したモデルを使用することで、乳がん術後の乳腺欠損部に対して、自家細胞移植を行い、その形状を復元することを目的としてその安全性に対する基礎的な実験を行うものである。本研究結果によって、移植された間葉系幹細胞が移植後に乳腺の欠損部を十分に補うことがわかり、また腫瘍化などの心配なく今後の自家細胞移植に安全に使用できる可能性が示唆された。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】23689059 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

幹細胞 / 臓器再生 / 再生医療 / 組織工学 / 肝移植 / 大動物 / 細胞外マトリックス

【研究成果の概要】

脱細胞化臓器骨格は、再生細胞の足場として有用であるだけでなく臓器特有の三次元構造から外科的に移植可能なマクロ構造へ連続する血管網、細胞外マトリックス構造を有している。我々はiPS細胞技術の臨床応用に向けて、ブタの肝臓を用いて脱細胞化骨格の移植手技の定型化に努めてきた。移植後の長期的機能維持を目指し、還流血液の凝固の問題をクリアするため、内皮細胞や抗凝固粒子による門脈系の被覆、門脈カテーテルを用いた抗血栓薬の持続投与によって大幅な改善を得た。今後は、膵臓・小腸を含めた本技術の幅広い応用の可能性を含め、脱細胞化臓器骨格を基盤としiPS細胞を用いた再生医療を実現すべく更に本研究を推進していきたい。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2011-04-01 - 2014-03-31

【配分額】26,650千円 (直接経費: 20,500千円、間接経費: 6,150千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】22390291 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ES cell / iPS cell / stem cell / 軟骨再生 / Scaffold / 軟骨分化 / 骨分化 / Stem cell / scaffold / 幹細胞 / 組織工学 / 骨再生 / スキャフォールド

【研究成果の概要】

今までに確立したヒト滑膜間葉系幹細胞（MSC）由来三次元人工組織（Tissue Engineered Construct, TEC）を作製する技術を用いて、ウサギ胚性幹細胞由来MSCでTEC（ES-TEC）を作成した。ES-TECは軟骨分化誘導後に滑膜MSC-TEC(Sy-TEC)と比べ軟骨関連遺伝子の発現が有意に高値であった。ウサギ膝関節骨軟骨欠損へのTEC/β-TCP複合体移植を行いに修復組織を検討したところES-TECでSy-TECに比しては硝子軟骨様組織による修復が促進されており、臨床応用が期待できる。またiPS細胞を用いて短期間でTECを作成する技術も開発した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010-04-01 - 2014-03-31

【配分額】18,200千円 (直接経費: 14,000千円、間接経費: 4,200千円)

【研究分野】医用生体工学・生体材料学

【研究領域課題番号】16200032 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生骨 / 組織エレメント / 幹細胞 / 移植 / TCP / 力学特性 / 骨組織 / 凝集塊 / 骨再生 / 組織工学 / 骨髄由来細胞 / 細胞凝集体 / リン酸三カルシウム / 血管新生 / 細胞凝集塊

【研究成果の概要】

骨の発生段階で起る細胞間相互作用を生体外で再現することによって,短時間で骨様の特徴を惹起する組織体(微小骨エレメント)を作製し,あらゆる骨欠損に適応可能な培養骨の開発を目指した.ヒト骨髄から採取した間葉系細胞(MSC)を培養により増殖させたのち,非接着性のwell中に高密度播種し,旋回培養することにより,大量の細胞凝集体を作製した.また,8週令のヌードラットの頭蓋冠骨に骨欠損(直径8mm)を作り,MSC凝集体や人工材料(β-TCP顆粒),それらを併用したものをサンプルとして移植した.移植後8週目でラットを屠殺し,μCTによる観察,組織切片の染色(H.E.染色),及び力学試験(3点曲げ試験)により評価した.
作製したMSC凝集体にCalcein・PI二重染色を施し観察した結果,細胞の壊死は殆ど見られず,細胞の生が確認できた.また,MSC凝集体をヌードラット骨欠損モデルに移植に使用したサンプルにおいて,H.E.染色により新生骨の形成が確認された.また力学試験の結果,強度は既存骨に劣るものの,十分な強度を持っていた.一方,MSC凝集体とβ-TCP顆粒を併用したサンプルでは,新生骨の形成は確認されたものの,β-TCP顆粒が残存していた.また,力学的強度はMSC凝集体のみを移植したサンプルに比べて低くなった.また,β-TCP顆粒のみを移植に用いたサンプルでは,新生骨の形成は確認されず,β-TCP顆粒は残存し,力学的強度はさらに低くなった.以上より,MSC凝集体のみを用いる骨再生法は組織学的,力学的観点において,β-TCP顆粒を用いる骨再生法よりも優れている可能性が見出された.

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2004 - 2007

【配分額】48,230千円 (直接経費: 37,100千円、間接経費: 11,130千円)

【研究分野】外科系歯学

【研究領域課題番号】16390578 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アメロゲニン / エナメル質 / 歯胚 / 歯胚細胞 / 歯胚上皮細胞 / 組織工学 / 担体 / 培養 / 歯乳頭細胞 / 歯髄細胞 / 歯嚢細胞 / 幹細胞 / 細胞培養 / フィーダーレイヤー / 歯胚組織

【研究成果の概要】

この研究において二つのことを新しく発見した。
1)歯胚中の3種類の細胞、歯胚上皮細胞、歯乳頭(歯髄細胞)および歯嚢細胞の培養条件を検討し、特に歯胚上皮細胞においては新しい培養方法を開発した。
鐘状期歯胚から無血清培地を用いて上皮細胞のみを選択し、3T3細胞をフィーダーレイヤーとして混合培養することで、長期培養に成功した。10継代した培養細胞のmRNAを採取し歯胚上皮系細胞特異的な遺伝子であるアメロジェニン、アメロブラスチン、エナメライシンの発現を確認し、前エナメル芽細胞の形質を維持していた。次に、歯乳頭(歯髄)組織中から幹細胞の特性を持つ細胞をFACSによって分離することに成功した。この細胞は従来、他の組織の幹細胞のマーカーとして報告されている遺伝子群を発現することを確認した。最後に、歯嚢組織から単細胞クローンの採取に成功し、その細胞を長期培養できる条件を見出した。また、その単細胞クローンは歯根膜の前駆細胞の特性を示すことがmRNAによるRT-PCRの解析から確認した。さらに、この単細胞クローンを歯根膜細胞に有利に分化する培養条件を見出した。
2)培養歯胚上皮細胞がin vivoにてエナメル質形成能を持つことがわかった。
3-5継代した培養歯胚上皮細胞と同時期の歯乳頭細胞をコラーゲンスポンジの担体の上で混合させて、免疫不全ヌードラットの腹部大網中に移植する。移植後4週・8週にて試料を採取して、組織学的および免疫組織化学的に評価したところ、移植後4週にて取り出した試料にエナメル質の形成が観察できた。この組織はサイトケラチン14抗体に陽性であり、アメロゲニン抗体陽性のエナメル芽細胞が観察できた。これらの結果から、われわれが開発した培養方法にて培養・増殖させた歯胚上皮細胞はアメロゲニンのタンパクを分泌し、歯髄細胞と混合させることでエナメル質を形成することがわかった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】12,800千円 (直接経費: 12,800千円)

【研究分野】熱工学

【研究領域課題番号】12555060 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

自己組織性 / 組織工学 / 細胞培養 / バイオメカニクス / 胆管形成 / バイオ人工肝臓 / 肝細胞 / 細胞コロニー / 幹細胞 / 分化誘導

【研究成果の概要】

細胞を用いたバイオ人工肝臓の実用化のためには,生体外において三次元細胞組織モジュールを構築する必要がある.ラットの肝臓には,幹細胞の一種と考えられる増殖能力の強い肝細胞が存在する.この小型肝細胞と名付けられた細胞を分離して非実質細胞と共培養すると,肝組織に類似した三次元構造が構築される.
小型肝細胞は,培養後2週間ほど経つと非実質細胞に囲まれたコロニーを形成し,一部の細胞は成熟化し形態的に盛り上がってくる盛り上がった肝細胞間には白い筋状の構造が形成され,培養後3〜4週間ほどで複雑に繋がったネットワーク構造を形成する.
今回我々は,この白い筋状に見える毛細胆管様構造が生体内と同様の極性を保持しているか否か検討した.また,位相差顕微鏡でのタイムラプス撮影により毛細胆管の収縮運動について解析し,再生された毛細胆管に対するEndothelin-1とA23187の収縮運動への影響について検討した.
本実験系において再形成された毛細胆管は管状のネットワーク構造を形成し,それらが協調して収縮運動を行なうことが分かった.毛細胆管の長さ方向に細胞10〜20個分の距離が離れていても,少なくとも20秒以内に同期して収縮を開始していることが分かる.また,このように急激に収縮するタイプの毛細胆管運動は,細胞1個分の長さのみが収縮することはほとんどなく,細胞数個分に渡って同期して収縮することが多い.
この毛細胆管収縮運動の協調作用は,ギャップ結合を介したシグナル伝達によって調節されていると考えられる.毛細胆管収縮のセカンドメッセンジャーである[Ca^<2+>]_iやIP_3は,肝細胞のギャップ結合を介してシグナルを伝達することができる.本研究における再形成毛細胆管においても細胞間にギャップ結合タンパク質であるコネクシン32,26の発現が認められている.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】13,500千円 (直接経費: 13,500千円)