【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】15K06803 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

UHRF1 / 卵母細胞 / 初期発生 / 着床前発生 / 生殖細胞 / エピジェネティクス / DNAメチル化 / 卵子 / 卵子形成 / 配偶子形成 / リプログラミング / ヒストン修飾

【研究成果の概要】

研究代表者らは、一般的な細胞では核に局在するUHRF1が、卵母細胞および着床前胚では、大部分が細胞質に局在することを見出した。これらの細胞で一部核内に局在するUHRF1は卵母細胞成長期の新規DNAメチル化に関与し、着床前胚ではゲノムワイドに基底レベルのメチル化を維持することを見出した（前之原ら, 2017）。またUHRF1母方ノックアウトマウス胚は着床前後に致死となること、UHRF1は卵母細胞の細胞骨格形成に重要な役割を担っていること、UHRF1存在下で形成された細胞質が正常な発生に重要であること、UHRF1は着床前発生において正常な染色体分配と細胞分裂に重要であることなどを見出した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】18390452 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リンカーヒストン / 卵子 / エピジェネティクス / H1foo / ノックアウト

【研究成果の概要】

H1fooモルフォリーノによる機能抑制実験の結果、免疫染色およびウエスタンプロットにてインジェクション後20時間でH1fooが減少している傾向が見られ,44時間では検出されなかった.また、MOインジェクション卵においてコントロールに比べ卵成熟率は低下したが,単為発生率に差は見られなかった.さらにmRNA同時インジェクションのレスキュー実験では、MOのみインジェクションした卵に比べ卵成熟率は上昇した.MOインジェクション卵においてコントロールに比べ卵成熟率は低下したが、単為発生率に差は見られなかった。従って、哺乳類卵子においてH1fooが卵成熟過程に関与していることが示された。 H1fooノックアウトマウスの作成は、今回、DNAに結合すると考えられているexon 2の部分を欠損させたマウスを作成することとし、クラボウ社を通じて米国のiTL社においてヘテロマウスの作成を依頼した。iTL社において、ターゲティングベクターの設計・構築ならびにES細胞への導入が行われ、設計通りのネオマイシンカセットが導入されたES細胞が得られた。更にマイクロインジェクションが行われ、キメラマウスおよびヘテロマウスが作成された。平成19年7月の段階でヘテロマウスメス2匹とオス1匹が米国iTL社より慶應義塾大学医学部動物実験センターに搬入され、現在、ファウンダー系統の維持・繁殖及びホモマウスの作成を行った。現在、得られたホモマウスの表現形解析を開始し、H1fooKOマウスでは、卵子発育が抑制される傾向が得られた。更に、H1fooホモマウスでは、単為発生の増加に伴う卵巣における奇形腫の増加及び受精率の低下が認められた。以上の結果により、卵子特異的リンカーヒストンH1fooは、卵子の成熟、形成過程において重要な機能を有していると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】12,810千円 (直接経費: 11,700千円、間接経費: 1,110千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】16591684 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

卵子 / リンカーヒストン / リプログラミング / エピジェネティクス / リン酸化 / H1foo / マウス / マイクロインジェクション / モルフォリーノアンチセンス

【研究成果の概要】

今回我々はマウス卵子特異的に発現するリンカーヒストンH1fooの機能解析を行うことを目的にモルフォリノを利用してH1fooの発現阻害を行った。BDF1マウスよりPMSG刺激後48時間にてGV卵を回収し、H1fooに対するモルフォリノをマイクロインジェクションした。マイクロインジェクション後時間を追って免疫染色およびウエスタンブロッティングにてH1foo蛋白量の変化を観察したところ逆相補配列をもつコントロールのモフォリノをインジェクションした卵にくらべてH1fooが減少していることがわかり、40時間以上たっと免疫染色およびウエスタンブロッティングにてH1fooは検出されなくなった。そこでモルフォリノによりH1fooをノックダウンした卵をin vitro maturationさせて第1極体の放出による成熟率を検討した。その結果、コントロールにくらべノックダウン卵では有為に成熟率が低い傾向が得られた。但し、成熟した卵を単為発生させた場合、前核形成率でみた発生率に関してコントロールとの間に差はみられなかった。また、リコンビナントH1fooをMPF(Maturation Promoting Factor)の活性中心であるリコンビナントcdc2/cyclinBと放射性同位元素によってラベルしたATPと反応させることによって、H1fooがin vitroでリン酸化されるかどうか検討した結果、H1fooがMPFによってリン酸化された。以上の結果よりH1fooが卵成熟、すなわち減数分裂の過程で機能していることが強く示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】14571584 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リンカーヒストン / 哺乳類卵子 / エピジェネティクス / 体細胞核移植 / FRAP / クロマチン / 卵子 / ゲノムリプログラミング

【研究成果の概要】

体細胞核移植における卵子特異的リンカーヒストンH1ooの発現
平成14年度より体細胞核移植クローン胚を使用し、H1foo蛋白の発現の検討を開始した。また、除核卵子にGFP-H1c発現細胞の核移植を行い、体細胞型リンカーヒストンの移植胚における動態を観察した。H1foo蛋白は、GV期卵、MII期卵、核移植後、2細胞期の核に発現を認めたが、4細胞期には消失した。従ってH1ooは、卵子形成から体細胞核移植後配偶子の遺伝子発現が開始するまでの間、体細胞核に取り込まれ、局在していることが確認された。また、体細胞核移植数時間後に、体細胞型リンカーヒストンが消失することが確認された。
GFP結合H1oo, H1c蛋白の作成とFRAP法を用いた染色体への動的結合の検討
平成14年度にGFP-H1oo, H1c融合ベクターを制作し、H1oo, H1cを恒常発現した3T3細胞を作成した。14年から15年にかけて共焦点レーザー顕微鏡を用いてGFP-H1oo遺伝子の染色体結合動態についてFluorescence recovery after photobleaching(FRAP)法により検討した。FRAPによる解析により、H1oo-GFPは、コントロールである体細胞リンカーヒストンH1c-GFPに比べ50%recoveryが22秒と有意に速く、また、動的成分も92%と有意に高値を示した。従って、卵子特異的リンカーヒストンH1ooは、体細胞型リンカーヒストンに比べ、動的成分が多く、きわめて短時間にクロマチンに結合、解離を繰り返していることが示唆された。以上の結果より、卵子特異的リンカーヒストンH1fooは、クロマチン構造を柔軟にすることによって、卵子の核成熟・初期胚発生を誘導していることが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】4,000千円 (直接経費: 4,000千円)