【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】14207066 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / 子宮平滑筋 / 幹細胞 / 分化 / 再生医学 / 子宮筋 / 免疫不全マウス / DNAマイクロアレイ

【研究成果の概要】

本研究では、雌性生殖器官が有する様々な機能メカニズムを明らかにするために、その成体幹細胞の同定・分離・培養技術の確立を通じて、幹細胞システムの解明と再生医学への応用を目的とした。
1.雌性生殖器官における組織幹細胞の分離・同定および幹細胞特性の解明
a)子宮内膜の組織幹細胞
内膜はその高い再生能力から組織幹細胞の存在が強く示唆される。近年、組織幹細胞をside population細胞として分離する方法が開発された。月経周期を通して内膜にはSP(endometrial SP ; ESP)が存在し、免疫不全マウスへの移植実験では、ESP移植部位に腺管構造を有する内膜様組織が再構築され、加えて内膜組織の各コンポーネントより成る様々な組織も構築された。
b)子宮筋の組織幹細胞
子宮筋は妊娠・分娩時に著明な増大と細胞数の増加を示し、産褥期には急激にアポトーシスを起こす。そこで子宮平滑筋における組織幹細胞の同定と単離を目的として、ESP単離と同様の戦略に基づいて、ヒト正常子宮筋層から子宮筋SP(myometrial SP : MSP)を分離した。MSPは細胞周期上quiescentであり、in vitroで骨・脂肪細胞へ分化するとともに、in vivoでは平滑筋様の組織を構築した。
さらに、GeneChip解析によりESPやMSPの発現遺伝子群のなかにABCG2といった幹細胞マーカーが含まれていた。以上より、ESPやMSPが幹細胞的特性を有し、これらを中心とする幹細胞システムが雌性生殖器官に存在する可能性が示された。
2.内膜分化制御
分子標的という観点からヒストンアセチル化およびチロシンリン酸化経路を修飾する低分子化合物を用いたところ、短期間でかつ効率よく子宮内膜の分化を誘導し得た。内膜幹細胞の分化あるいは他の細胞系譜への細胞転換を行う上での基盤データが得られた。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】41,860千円 (直接経費: 32,200千円、間接経費: 9,660千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】13671743 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / 脱落膜 / ヒストンアセチル化 / エストロゲン / プロゲステロン / 分化 / trichostatin A / インシュリン様成長因子結合蛋白1 / コアヒストン / プロラクチン

【研究成果の概要】

性ホルモン依存性に月経周期を反復する子宮内膜の増殖・分化のメカニズムを、ヒストンアセチル化という側面から研究し、以下の点を明らかにした。
[1]ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤trichostatin A (TSA)による内膜間質細胞分化(脱落膜化)の促進
ヒト内膜間質細胞と腺細胞を分離・純化した後、性ステロイドならびにTSAの存在下で培養し、脱落膜化マーカーであるinsulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1)とprolactin (PRL)のmRNAの発現をcompetitive RT-PCRにより定量解析した。TSAは、用量依存性に性ステロイドによるIGFBP-1ならびにPRL発現を増強した。一方腺上皮細胞では、同様の処理によっても両者の発現は誘導しなかった。
[2]子宮内膜の増殖・分化を担うヒストンアセチル化酵素の同定
上記培養細胞よりヒストンを抽出し、特異的アセチル化ヒストン抗体によるウエスタンブロットを用いてアセチル化されるコアヒストンの種類とそのアセチル化リジン残基を検討したところ、SRC-1およびCBP/p300が内膜の分化に関与するヒストンアセチル化酵素である可能性が示唆された。
[3]クロマチン微小構造変化領域の同定
アセチル化ヒストンH4抗体を用いたクロマチン免疫沈降法により,IGFBP-1プロモーターにおいてプロゲステロン応答配列が存在する領域と非存在領域のそれぞれの検出をPCRにより試みたところ、応答配列存在領域のPCR産物のみが,性ステロイド処理群で検出され,TSA同時添伽により相乗的に増量した.
以上より、TSAは,ヒストンアセチル化によるプロゲステロン作用の増強を通じて,内膜間質細胞の分化を促進することが示され、内膜分化にヒストンアセチル化が深く関与していることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】4,100千円 (直接経費: 4,100千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】12470348 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / シグナル伝達 / チロシンリン酸化 / Srcキナーゼ / ヒストンアセチル化 / レドックス / シグナル伝達経路 / 分化 / 性ステロイドホルモン / 脱落膜 / チロシンキナーゼ / c-Src

【研究成果の概要】

本研究では、子宮内膜の多様な機能発現を担う細胞内シグナル伝達経路の解明を目的として、チロシンリン酸化、ヒストンアセチル化、酸化還元(レドックス)反応について検討し、以下の点を明らかにした。
1.リン酸化:内膜分化(脱落膜化)系において、種々の蛋白のリン酸化状態が変化すると同時に、src familyチロシンキナーゼのひとつであるc-Srcが活性化していた。活性化型c-Srcを認識する抗体clone 28を用いることにより、ヒト子宮内膜及び脱落膜において、分化に伴って活性化型の発現増強を検出した。次にsrc familyチロシンキナーゼの阻害剤を用いたところ、逆説的にc-Srcは活性化し、分化も促進された。阻害剤の特異性の限界を鑑み、c-Srcの野生体および一部の変異体を発現するadenovirusを作製し、内膜細胞に感染させてその発現を確認した段階である。一方、2次元電気泳動法によりチロシンリン酸化蛋白を網羅的に解析し、分化特異的なリン酸化スポットを約20種類同定した。また、齧歯類の脱落膜化においても、活性化型の発現が増強しており、現在c-Srcノックアウトマウスの内膜分化能を検討中である。
2.ヒストンアセチル化:脱アセチル化酵素阻害剤の内膜分化への影響を検討したところ、細胞・薬剤特異的に性ステロイド依存性分化を促進した。その際、一部のコアヒストンの特定の部位がアセチル化されていた。
3.レドックス反応:内膜の増殖・分化の際、レドックス環境を調節するチオレドキシンが誘導された。分化過程では細胞外へ放出され、paracrine/autocrineに増殖を調節する可能性が示された。
内膜機能発現には、様々な蛋白修飾を通じたシグナル伝達経路の活性化が重要であることが示唆された。雌性生殖器官疾患に対して、シグナル伝達を標的にした創薬および治療開発の可能性を示唆する研究成果が得られた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】16,600千円 (直接経費: 16,600千円)