【研究領域課題番号】19H02913 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Redd2 / 膵β細胞 / 酸化ストレス / Nrf2 / p53 / ストレプトゾトシン / 咀嚼 / アンドロゲン / インスリン / アポトーシス / 2型糖尿病 / 高脂肪食 / Redd2/Ddit4l / 食品成分 / インスリン分泌 / ストレス応答

【研究成果の概要】

本研究では、膵β細胞機能不全に陥るメカニズムについて解析を行った。Redd2は、膵β細胞に酸化ストレスを生じさせるストレプトゾトシン（STZ）によって発現が増加すること、Redd2の発現をノックダウンするとSTZによるINS-1 β細胞生存能の低下が抑制されることを見出した。発現増加には、Nrf2とp53の関与が示唆された。Redd2ノックアウトマウスでは、高脂肪食摂食時にβ細胞機能の改善により耐糖能が改善することが判明した。Redd2は、膵β細胞障害マーカーとしての利用が期待できる。さらに、本研究では、咀嚼や男性ホルモンとβ細胞機能の関連についても明らかにした。

【研究の社会的意義】

2型糖尿病は、QOLを低下させ寿命を短縮させるため、その予防は健康長寿社会の構築において重要な課題となっている。日本人を含むアジア人ではインスリン分泌低下、すなわち膵β細胞機能不全に陥って血糖維持機構が破綻しやすい特徴がある。2型糖尿病を予防するために、食品科学分野に対しては、科学的エビデンスに支えられた機能性食品や食生活の提示が求められている。しかし、機能不全を予防する上で必須となるその発症メカニズムの理解はあまり進んでいない。本研究では、膵β細胞の機能不全に陥る原因として酸化ストレスによるRedd2の発現が増加することが一因となることを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究分野】形成外科学

【研究領域課題番号】20592104 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

再生医学 / 移植 / 再生医療 / アポトーシス / 軟骨再生 / 軟骨膜 / 虚血 / P53 / 移植・再生医療 / 再生軟骨

【研究成果の概要】

再生軟骨には周囲の軟骨膜様組織の機能が重要であると予想される。本研究の目的は、軟骨膜様組織の血行が軟骨再生に与える影響を解明し、再生軟骨維持法の開発に情報を提供することである。p53遺伝子欠損マウスを用いて、再生軟骨における低酸素ストレスの影響評価を行った。その結果、再生組織周囲の血行は軟骨再生に影響を及ぼし、移植組織への血行は再生軟骨の生体内代謝・形状維持に重要な因子であることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究分野】免疫学

【研究領域課題番号】18890054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インターフェロン / IRF / アポトーシス / p53

【研究成果の概要】

生体防御において免疫系の賦活化は必須であり、また適時の適当な免疫応答が恒常性維持に重要である。IRF(インターフェロン制御因子)ファミリー転写因子はインターフェロン誘導のみならず、種々の免疫反応の誘導にも重要な転写因子であり、その異常によって自己免疫反応を含め、免疫応答の破綻をきたす。IRF-5は病原体関連分子の認識受容体であるToll-like receptor(TLR)の刺激により活性化され、炎症性サイトカインの誘導に重要な転写因子であることを明らかにしたが、TLR下流でのIRF-5活性化機構は不明である。この活性化機構のメカニズムの一端を解き明かすべく検討を進めた。まず、IRF-5遺伝子欠損マクロファージを用いてTLR刺激での誘導遺伝子についてマイクロアレイ解析によって検討したところ、これまで報告した炎症性サイトカインのみならず、その他の誘導遺伝子においても顕著な減弱がみとめられる遺伝子が複数存在することが明らかとなった。さらに興味深いことには、刺激において通常は発現が抑制されるような遺伝子群が、IRF-5遺伝子欠損細胞において、むしろ誘導が増強されていることが見いだされた。これらはプロテアーゼなど代謝に必要な酵素群の遺伝子であった。通常は感染時などに抑制されるべき分子が、逆に誘導されることから、IRF-5は自己を攻撃することに繋がる分子の発現を抑える役割を持っていることが示唆された。最近IRF-5について、自己免疫疾患の一つである全身性ループスエリテマトーデス(SLE)との関連が指摘されており、今後はこのIRF-5の遺伝子誘導の抑制機能にも焦点をあてつつ、研究計画に沿って検討を進めていく予定である。

【研究種目】若手研究(スタートアップ)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】2,420千円 (直接経費: 2,420千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】18591654 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

CDK6 / Cyclin D1 / p53 / 軟骨細胞 / 骨芽細胞 / アポトーシス / Cyclin Dl

【研究成果の概要】

骨・軟骨細胞の分化、増殖を調整する細胞周期関連分子CDK6に注目し、軟骨細胞及び骨芽細胞に特異的にCDK6を強制発現させる遺伝子改変マウスを作成し解析した。CDK6とCyclin D1を同時に発現させると、細胞増殖が促進されると同時に、癌抑制遺伝子であるp53依存的にアポトーシスが誘導されることを発見した。更に骨芽細胞でCDK6が誘導したアポトーシスは、Bcl-2の導入で救済され、骨量が著名に増加した。骨増殖症のモデルマウスになる可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】4,040千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 540千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】17390089 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アポトーシス / RNA結合蛋白質 / KHドメイン / p53 / TGF-beta / エストロジェン / TPA / splicing / D8 / TGF-b / Bim / 3'-UTR / ノックアウトマウス / PNA

【研究成果の概要】

新規PNA結合蛋白質D8がアポトーシスを誘導する活性をもつことを見出しその分子機構を解析した。
1)D8はDNAストレスによるアポトーシズの誘導に重要な役割を果たしていることを見出した。
2)ルシフェラーゼ・アッセイ、クロマチン免疫沈降法によりD8のプロモーターがp53やTGF-betaシグナルにより直接に転写活性化されることを明らかにした。
3)D8がアポトーシスを誘導するためには、RNA結合活性をもつKHドメイン1,2両方が必要であった。
4)Bimの誘導がD8によるアポトーシス誘導に重要であることを明らかにした。
5)D8にエストロジェン受容体が結合し、mRNAのsplicingに関与することを示唆する結果を得た。
6)D8以外に染色体1,18,19に存在するファミリーを同定し、TPAによって発現誘導されることを見出した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】14,700千円 (直接経費: 14,700千円)

【研究分野】病態医化学

【研究領域課題番号】15390100 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA結合蛋白質 / p53 / TGF-β / アポトーシス / Bim / KHドメイン / 標的遺伝子 / ノックアウトマウス / TPA / 発現誘導

【研究成果の概要】

p53およびTGF-βによって発現誘導される新規遺伝子D8を見出し、以下の事実を明らかにした。
1)D8をHepG2などの癌細胞に強制発現するとアポトーシスを誘導する。RNAiを用いてD8の発現を抑制するとp53やTGF-βによるアポトーシスの誘導が阻害される。これらの結果から、D8はp53やTGF-βによるアポトーシスの誘導に重要な役割を果たしていると考えられた。
2)5FU、アドリアマイシンなどによりゲノムの損傷をうけるとD8の発現が増加すること、これらの薬剤によるアポトーシスにD8が重要な役割をはたしていることを見出した。
3)BH3 onlyファミリーに属すBimがD8のKHドメインに結合することを見出した。RNAiを用いてBimの発現を抑制するとD8によるアポトーシス誘導が阻害されることから、BimはD8によるアポトーシス誘導に重要な役割を果たしていると考えられた。
4)D8はアポトーシスを誘導する活性のあるBimのmRNAを安定化することによりアポトーシスを誘導していると考えられた。
5)D8ノックアウトマウスの作成を進めた。
6)D8と相同性が高くドメイン構造も類似した3種類のタンパク質をコードする遺伝子(D8-2、D8-3およびD8-4)が存在し、D8ファミリーを構成していることを見出した。D8ファミリーの各cDNA全長を単離し全構造を明らかにし、ノックアウトマウスの作製を進めた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】15,400千円 (直接経費: 15,400千円)

【研究分野】放射線科学

【研究領域課題番号】14370271 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Hyperthermia / Heat sensitization / SAPK / JNK / DNA-PK / wortmannin / p53 / U937 Cells / Cell death / Apoptosis / 温熱 / シグナル伝達 / p53 null / U937細胞 / 細胞死、アポトーシス / 温熱高感受性 / Akt / Wortmannin / リン酸化特異抗体 / 細胞死 / セラミド / 温熱療法

【研究成果の概要】

本申請では、温熱感受性のメカニズム、温熱応答、特に細胞死に至るシグナル伝達と応答遺伝子、タンパク質を明らかにする。そして温熱治療に有用な感受性修飾法の開発を長期目標とする。細胞の生死は、p53経路と別に、細胞の生存・増殖に関わるMAPK(Mitogen activated protein kinase),AKT経路と細胞死に関わるSAPK(Stress activated protein kinase)経路のバランスによって決定されるという仮説について、p53がnullで機能していないが温熱高感受性のU937細胞を用い、以下の解明を行った。
1)温熱応答に至るセカンドメッセンジャー分子、上流のシグナル伝達経路について解明
2)シグナル伝達に続き誘導される遺伝子群や応答タンパクのうち、温熱応答、特に細死感受性に関与する因子
3)温熱細胞死におけるDNA-PKの役割とwortmanninの温熱増感への関与のメカニズム
以上の研究の中で、温熱処理などでアポトーシスを誘導する細胞において、既知分子量とは異なる52kDa(p52)のJNKが誘導されてくること。p52JNKの発現誘導は、p54JNKの発現量減少と関係関係があること、更にp52は、P54JNKのカスパーゼ-3,7による分解産物であることをカスパーゼ阻害剤、p54JNKのアミノ酸置換体により証明した。細胞死に至る経路としてJNKの活性化によりc-Mycが急速に減少し、特異的inhibitorなどでc-Mycの減少を起こすと細胞死が起こることを証明した。wortmanninが示す温熱増感作用のメカニズムに関して、リン酸化部位特異抗体を用いたwestern blottingを中心にした実験やJNKのdominant negative作用をもつ変異細胞を用いた実験等からAKT経路の抑制ではなく、SAPK/JNK経路の活性化の増強によると考えられる結果を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】12,800千円 (直接経費: 12,800千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】13670543 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

p53 / Chk2(hCdsl) / 細胞周期チェックポイント / アポトーシス / DNA傷害 / Chk2(hCds1) / chk2 / 細胞周期 / NF-Y / 胃癌

【研究成果の概要】

消化器系癌を含む悪性腫瘍の多くは,癌抑制タンパクであるp53の機能が欠落している.また,Chk2(hCds1)はp53タンパクの機能を制御することで,DNA傷害時にアポトーシスおよび細胞周期チェックポイントに機能していると考えられている.一方,申請者らは各種細胞株におけるp53機能とChk2の発現の検討から,p53がChk2発現を負に制御していることを報告している.このことは,Chk2によってp53の機能が制御されるメカニズムのnegative feedback機構とも考えられるため,Chk2の発現制御は,DNA傷害時における細胞周期の調節機構およびアポトーシス誘導に極めて重要な意義をもつと考えられる.このため,申請者らはp53によるChk2発現抑制の分子機構の解明を試みた.
p53誘導細胞株を用いてp53とChk2発現をNorthernとWestern解析で検討したところ,Chk2の転写は,p53の発現を誘導すると著明に抑制されたp53によるChk2の発現抑制に重要な領域を,Chk2プロモーター領域を変異させたレポーター遺伝子を作成し解析したところ,p53によるChk2の転写制御には,Chk2プロモーター領域の-152^--138にあるCCAAT boxが必要であった.さらに,Gel Shift Assayで,そのCCAAT boxは転写因子NF-Yが結合することが分かり,NF-Yのdominant negative mutantを過剰発現させるとp53によるChk2の負の転写制御は消失した.最後に,p53に影響を受けないプロモーターを持つChk2発現ベクターを用いて,Chk2を発現させたp53正常細胞では,放射線を照射することによりG2/M期の細胞周期停止から再び細胞周期に入るのが遅れた.
以上から,Chk2の転写は転写因子NF-Yを介してp53により抑制され,その転写制御は,DNA傷害による細胞周期停止から,再び細胞周期に入るために重要な役割を持つことが判明した.

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】12770266 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質脱リン酸化酵素 / p53 / アポトーシス

【研究成果の概要】

放射線や紫外線、抗癌剤等でDNA損傷を受けた細胞ではp38MAPKおよび癌抑制遺伝子p53が活性化され、共同してアポトーシスが誘導される。p38やp53の活性化にはこれらの蛋白質のリン酸化が必要であるが、最近p38がp53を直接リン酸化して活性化し、アポトーシス誘導に寄与することが報告された。一方、細胞がDNA損傷から回復する際には、これらの分子は脱リン酸化により不活性化されると考えられるが、その分子機構は不明である。
Wip1はDNA損傷後にp53依存的に発現誘導されるSer/Thr脱リン酸化酵素として同定されたがその機能は明らかにされていない。我々はp38-p53経路の脱リン酸化による活性抑制機構にWip1が関与する可能性を想定し研究を行った。
始めに細胞にDNA損傷を含むストレス刺激を加えた際のWiP1の発現をノザンブロットにより解析したところ、様々なストレス刺激に応答してWip1遺伝子の強い発現誘導が起こることを見出した。さらに紫外線によるWip1の発現誘導にはp53およびp38両方の活性化が必要であることが確認された。またWiP1は核内で活性化されたP38と特異的に結合し、Thr残基を脱リン酸化することでp38を不活性化することを見出した。
次にWip1がp53のリン酸化および活性化に与える影響を検討したところ、Wip1の発現によりp53のSer33のリン酸化が間接的に抑制され、さらにWip1の強制発現は然外線によるp53の転写活性化およびアポトーシス誘導を抑制した。これらの結果から、紫外線照射によりp38を介してP53が活性化されるとWip1が発現誘導され、p38を脱リン酸化して不活性化するというネガティブフィードバック機構の存在が明らかになった。
またWip1に特異的に結合する蛋白質の同定を行い、Chk2キナーゼなどの複数の分子を同定した。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】2,400千円 (直接経費: 2,400千円)

【研究分野】食品科学・製品科学

【研究領域課題番号】10306008 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

食品アレルギー / TCRアンタゴニズム / 変異ペプチドリガンド / 腸管免疫系 / サイトカイン / 神経細胞 / 一酸化窒素 / アポトーシス / アナログペプチド / 脳細胞 / T細胞 / 細胞死 / p53 / IgE / 神経幹細胞

【研究成果の概要】

1.アレルゲンの分子構造変化と免疫応答の関係 T細胞抗原レセプタートランスジェニック(TCR-Tg)マウスのT細胞が認識する卵白アルブミン(OVA)の部分ペプチドOVA323-339の1残基置換アナログ40種は、それが誘起するT細胞のサイトカイン応答や抗体産生誘導のパターンの違いにより、4つの群に分けることができた。同様のパターン変化はOVA323-339濃度の変化によっても観察された。さらに、T細胞応答を抑制するアナログも同定し、これの腹腔内投与はinvivo食品アレルギー反応モデルにおいて抑制効果を示すことを明らかにした。
2.アレルゲンと腸管免疫系の応答作用OVAを経口投与したTCR-Tgマウスのパイエル板細胞は抗原刺激に対しIFN-γ、IL-5を分泌し、腸管上皮内リンパ球はIFN-γを分泌した。一方、脾臓CD4T細胞のサイトカイン産生能は減弱し、経口免疫寛容が誘導された。この寛容T細胞において、TCR刺激に対する細胞内Ca^<2+>濃度の上昇等に障害が認められた。また、OVA経口投与により胸腺細胞、各リンパ組織のCD4T細胞のアポトーシスが観察され、p53欠損マウスにおいて抗体レベルの経口免疫寛容が部分的に解除された。パイエル板細胞の抗原提示能と脾臓細胞の抗原提示能の違いについて明らかにした。
3.腸管免疫系と神経系の相互作用 神経幹細胞の培養系を用い、神経系細胞に対するサイトカインの作用を解析した。IL-6ファミリーサイトカイン(IL-6,IL-11)およびTGF-βファミリーサイトカイン(BMP-2,BMP-4)の作用により、神経細胞の活動を補助するグリア細胞の新生が誘導された。また、免疫系のストレス応答により誘導型-酸化窒素合成酵素の発現が誘導され、結果的に周囲に存在する神経細胞が傷害され、場合によってはp53依存的にプログラム細胞死が誘起されることが判明した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1998 - 2000

【配分額】37,100千円 (直接経費: 37,100千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】09877242 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

大腸癌 / Apoptosis / Bcl-2 / Bax / p53 / Caspase / アポトーシス / テロメラーゼ

【研究成果の概要】

悪性腫瘍では、細胞増殖と細胞死のバランスが破綻し無秩序な細胞増殖が生じている。大腸癌におけるApoptosisの異常を明らかにする目的でApoptosis関連遺伝子の発現を解析した。大腸癌切除例、ヒト大腸癌細胞株を対象として、Apoptosis抑制因子Bcl-2、Bcl-XL,Apoptosis促進因子Bax、Bad、Bak、Apoptosis EffectorであるCaspase Family(ICE、CPP32、ICH-1L)、さらに、癌抑制遺伝子p53の発現をWestern Blottingで解析し、Densitometerを用いて定量化、癌部分と正常粘膜のそれぞれの発現を比較した。すべての症例において、Bax、Bad、Bak、CPP32、ICH-1Lは癌、正常粘膜の胃方に発現が認められた。Bcl-XL.Bax.Bad.CPP32、ICH-1L、p53は、正常粘膜に比較して癌で発現が高い傾向が認められた。逆に、Bcl-2、Bak、ICEは、癌に比較して正常粘膜で発現が高い傾向が認められた。個々のの腫瘍における各Apoptosis関連遺伝子の発現パターンは多様であるが、高頻度に認められた顕著な変化は,癌におけるBcl-XLの発現上昇、Bcl-2の発現減少であった。各々の因子の間に朗らかな相関は認められなかった。
大腸癌におけるApoptosisの抑制には、Bcl-XLの過剰発現、Bakの発現低下が関与している可能性が示唆された。特に、Bcl-XLの発現上昇は、大腸癌の発生に重要な役割を果たしている可能性が考えられる。癌で認められたApoptosis促進因子Bax、Badの発現上昇、Apoptosis Effector CPP32、ICH-1Lの発現上昇は、生体反応として、癌細胞を排除するためのApoptosis誘導機構も活性化されている可能性を示唆するものと考えられる。個々の腫瘍で異なる、Apoptosis関連遺伝子の発現異常は個々の腫瘍の生物学的性質の多様性を反映している可能性が考えられる。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,300千円 (直接経費: 2,300千円)

【研究分野】消化器外科学

【研究領域課題番号】07671368 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Apoptosis / 放射線療法 / 化学療法 / 癌 / Bcl-2 / p53 / 食道癌 / 大腸癌 / bcl-2

【研究成果の概要】

食道癌と大腸癌細胞株において、Apoptosis関連遺伝子p53、Bcl-2、Bax、Bcl-XL、Bcl-XS、Bak、Badの発現をWestern Blottingを用いて解析した。p53の発現は、食道癌細胞株、大腸癌細胞株のそれぞれ約50%と約80%に認められた。一方、Bcl-2の発現は、食道癌細胞株、大腸癌細胞株のそれぞれ約30%と約20%に認められた。分子量の異なる2種類のBcl-2蛋白を発現している食道癌細胞株が認められた。p53、Bcl-2、Baxの発現の間に明らかな相関は認められなかった。p53遺伝子解析から、Mutant p53蛋白を発現している細胞株とWild-type p53蛋白を発現している細胞株があることが示唆された。Bax、Bcl-XL、Bcl-XS、Bak、Badの発現は、ほとんど全ての細胞株で認められたが、その発現量には細胞株の間で相違が認められた。食道癌細胞株における化学療法剤MMC、CDDPに対する感受性を解析した。MMC、CDDPを加えて、p53蛋白の発現上昇が認められる細胞株では、Apoptosisが誘導され、抗癌剤に対する良好な感受性が観察された。一方、p53蛋白の発現上昇が認められない細胞株では、抗癌剤に対する抵抗性が認められた。したがって、MMC、CDDPに対する感受性は、細胞がApoptosis誘導刺激に対する反応性を保持しているか否かにかかっており、p53-dependentなApoptosisが関与していることが示唆された。さらに、直腸癌に対する放射線療法感受性とp53、Bcl-2、p21の発現の相関を検討し、p53(+)/p21(-)の腫瘍は放射線療法に対して抵抗性を示し、p53(-)/P21(+)の腫瘍は放射線療法に対して良好な感受性を示すことが明らかになった。化学療法、放射線療法に対する感受性を規定する因子として、p53が重要であると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1995 - 1997

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)