【研究分野】泌尿器科学

【研究領域課題番号】16390469 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

NF-κB / 泌尿器系癌 / アポトーシス / 転移 / 悪液質 / 前立腺癌 / 放射線治療 / 細胞周期 / IL-6 / STAT3 / 膀胱癌 / 殺細胞効果

【研究成果の概要】

NF-κBは炎症性サイトカインや抗アポトーシス蛋白の誘導など様々な生体反応に関与している転写因子であり、泌尿器科系悪性腫瘍においても、癌の進展や転移、抗癌剤や放射線治療に対する抵抗性、悪液質などの腫瘍随伴症候群など様々な病態生理に関与していると想定される。dehydroxymethylepoxyquinomicin(DHMEQ)は新規に合成された強力なNF-κB阻害である。NF-κBはホルモン抵抗性前立腺癌や浸潤性膀胱癌において恒常的に活性化されており、DHMEQはNF-κB活性を抑制し、アポトーシスを誘導することを見出している。さらには前立腺癌の放射線抵抗性においてNF-κBの活性化が重要な役割を果たしており、DHMEQで前処置することにより放射線感受性を高めることが示され、その効果はG2/M cell cycle arrestを介するものであった。さらにはサイトカイン産生膀胱癌細胞であるKU-19-19細胞に対してアポトーシスの誘導と血管新生阻害を介して抗腫瘍効果を示すことを見出した。また、MBT-2細胞を用いた肺転移モデルにおいてもDHMEQが肺転移を抑制することが示された。一方、進行性前立腺癌患者ならびにJCA-1担癌マウスにおいて、NF-κB依存性サイトカインであるIL-6の血清濃度が増加しており、IL-6が血清アルブミンやコレステロール値、ヘモグロビン濃度やbody mass indexさらには生存率などと関連していることが示された。担癌マウスにおいてDHMEQは血清IL-6を抑制し、悪液質を改善した。このように、DHMEQによるNF-κB活性の抑制は進行性泌尿器系癌に対する新たな分子標的治療となりうることが示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】13,500千円 (直接経費: 13,500千円)

【研究分野】整形外科学

【研究領域課題番号】16659412 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

TE型X線源 / FE型X線源 / ミニチュアX線源 / 放射線治療 / アポトーシス / 3SB細胞

【研究成果の概要】

本研究は従来のX線源(Thermionic emission type)とミニチュアX線源のもととなるField-emission typeとを用いX線を腫瘍細胞に照射し、照射後の腫瘍細胞の反応を分子生物学的に解析、比較検討しミニチュアX線源の抗腫瘍効果が従来のものと同等以上であることを証明することにより、ミニチュアX線源を使った新しい放射線治療(生体腔内照射など)の開発の意義を確立することを目的とする。当初、従来使われているX線照射装置(TE型)とミニチュアX線源を使って細胞の照射後の変化を調べる予定であったが、分子生物学的に解析をするにあたり試料となる細胞の量をある程度得るために、それなりの大きさのディッシュで照射をする必要があり、したがってミニチュアX線源ではなくある程度の大きさのX線源(もちろんFE型ではある)を使用する事になった。放医研から3SB細胞というマウスの胸線のリンパ腫の細胞を分譲して頂き、これで照射実験を開始した。
1.FE型でもTE型同様照射後にDNAのDSBが生じることをH2AXのリン酸化で確認した。
2.TUNEL染色による解析ではアポトーシスの定量は困難な点があったがTE型、FE型のいずれのX線管でもX線照射によってアポトーシスが誘導されて細胞が死に至る。両者に違いはみられなかった。
3.フローサイトメトリーによる細胞周期の解析ではX線照射によって3SB細胞ではG1-arrestがおこらずG2/M-arrestが確認された。また細胞周期の進行はアポトーシスとあまり関係なかった。両者に違いはみられなかった。
4.ウエスタンブロッティングによる蛋白の発現状況の解析では
P53,P21,Chk1,Chk2いずれも照射によって反応を示したが両者に違いはみられなかった。以上からFE型の生物学的効果はTE型と同等であることが分かった。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】3,200千円 (直接経費: 3,200千円)

【研究分野】泌尿器科学

【研究領域課題番号】13671674 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

前立腺癌 / bcl-2 / アポトーシス / diethylstilbestrol / 放射線治療

【研究成果の概要】

前立腺癌由来樹立細胞株PC-3およびJCA-1細胞においてbcl-2 antisense oligonucleotide (bcl-2 AS ODN)は濃度依存性に抗腫瘍効果およびアポトーシスを誘導し、Bc1-2蛋白の発現を抑制した。bcl-2 AS ODNを併用したときの放射線治療による抗腫瘍効果の増強をcolony forming assayを用いて検討したところ、bcl-2 AS ODNはbcl-2 S ODNやcationic lipidに比べて、1Gyの放射線治療による平均colony数を有意に抑制した(colony数:26.5vs38.0、66.7)。また2Gyの放射線治療併用でのcolony数はそれぞれ16.2、31.4、52.0でありbc1-2 AS ODNは放射線治療の抗腫瘍効果を増強することが示された。
Diethylstilbestrol (DES)はPC-3細胞に対して濃度依存性の細胞障害活性ならびに細胞内活性酸素(ROS)を誘導した。Buthionine sulfoximine (BSO)は細胞内glutathione濃度を有意に低下させDESの細胞障害活性ならびにDESによる細胞内ROS誘導能を有意に増強させた。bcl-2 AS ODNはDESにより誘導される殺細胞効果ならびにアポトーシスを有意に増強したが細胞内のglutathione濃度やDESによるROS誘導能に変化を与えなかった。
以上の結果より、PC-3細胞においてBSOはDESで誘導される抗腫瘍効果やROSの産生を増強することが示された。一方、bcl-2 AS ODNはPC-3細胞内のglutathione濃度やROS産生量に有意な影響を及ぼすことなく,アポトーシスを介する機序によりDESで誘導される抗腫瘍効果を増強することが示された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】放射線科学

【研究領域課題番号】11670913 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

放射線治療 / 染色体異常 / 全身照射 / 晩期放射線障害 / 放射線照射 / 細胞周期 / アポトーシス / 遺伝子突然変異

【研究成果の概要】

【はじめに】平成11年度はボランティアおよび患者さんより採取した真皮細胞を用いて、in vitroでの放射線照射後の細胞生存率測定、細胞周期の測定、アポトーシス発生頻度の測定を行った。しかしながらPEのばらつきが大きく同一のヒトから得た真皮細胞でも実験毎にPEが異なり、生存率曲線が一定の傾向を示さなかった。またアポトーシスに関しても、アポトーシス発現頻度のばらつきが大きく一定した傾向が得られなかった。ヒト真皮細胞は成長速度も遅く非常に扱いにくい細胞であった。これらの知見から実験系を見直し、平成12年度は、X線照射後にヒトリンパ球に発生する染色体異常の、in vitro、in vivoでの定量を試みた。この手法をもちいて、放射線二次発癌など、晩期放射線合併症の発生を予測、評価できると考える。【方法】全身照射(TBI)は、2Gyの照射を、1日2回、3日間施行する。照射前および2Gyの照射毎に採血を行いPHAを添加培養した。またTBI前に採血した血液を1mlずつ7本のカルチャーフラスコに分け、TBIのスケジュールにあわせて実験用X線照射装置で2Gyずつ照射し、PHAを添加培養した。さらにコルセミドを添加培養し低張処理を行った。カルノア液で固定しスライドグラスに展開May-Gruenwald Giemsa染色を行ったのち鏡検した。【結果】照射線量と染色体異常頻度の関係を検討したが、照射線量の増大に伴いdicentricおよびfragmentの発生頻度は、TBIとin vitroでほぼ同様の増加傾向を示していた。【まとめ】TBIとin vitroでのリンパ球の照射線量と染色体異常発現のDose-response curveはほぼ同様の傾向がみられた。このことから、in vitroの実験は、生体内リンパ球被曝の影響を忠実に再現できると考えられた。広島・長崎のデータでは、放射線被曝と白血病の発生に、相関が認められており、この手法を用いて、放射線被曝と発ガンとの関係を検討していく上で理想的なモデルとなる可能性がある。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1999 - 2000

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】放射線科学

【研究領域課題番号】08671051 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

放射線治療 / 重粒子線 / 遺伝子突然変異 / LET / アポトーシス / RBE

【研究成果の概要】

マウス由来の正常組織細胞(V79)、ヒト卵巣癌由来の細胞(RMG1)、ヒト乳癌細胞(MDA-MB231)およびヒト食道癌細胞(TE24)を用いて重粒子線照射後の細胞感受性と、照射後に発現したhprt locusの遺伝子突然変異に関する検討を行った。すなわち各種細胞の単層培養を行い、X線、炭素粒子線(20Kev/μm、80keV/μm)、ネオン粒子線(80keV/μm)による照射を施行し、colony法により放射線感受性を検討し、また6-thioguanin酸性株の定量から、hprt locusの遺伝子突然変異発現頻度を検討した。この結果少なくともV79,RMG1,MDA-MB231細胞において以下の実験結果が得られた。同一線量では重粒子線はX線に比較して殺細胞効果が強く、炭素粒子線ではLETが上昇すると殺細胞効果がさらに強まること、同一のLETではネオン粒子線の方がわずかに殺細胞効果が弱いことが示された。また、遺伝子突然変異は、重粒子線照射ではX線照射と比較すると非常に高頻度で、炭素粒子線ではLETが上昇すると突然変異誘発頻度がさらに上昇すること、同一のLETではネオン粒子線で特に高線量照射時に明らかに突然変異誘発頻度が低下することが示された。TE24においてもほぼ同様の傾向が認められたが今後さらに数回の追試実験が必要である。さらに、これらの細胞を用いて、様々な照射線量でアポトーシス発現頻度の定量を試みた。アポトーシスの定量は、APO2.7モノクローナル抗体を用いて、フローサイトメーターにより測定を行った。APO2.7モノクローナル抗体は、アポトーシスを起こした細胞のミトコンドリア膜の発現する38kDのタンパク(7A6抗原)を認識する抗体にPE標識を行った抗体であり、細胞に反応させた後にその蛍光量を測定することによりアポトーシスを起こした細胞を定量することができる。また、7A6抗原はアポトーシスの初期段階(DNAの断片化、クロマチンの凝集以前の段階)から発現するため、ジギトニンによる膜透過処理を行えばアポトーシス初期段階の細胞も検出可能である。しかしながら本測定法は、細胞を蛍光色素で染色後レーザー光を当て反射光を解析する方法であり、細胞の存在状態や条件(細胞数、凝集状態など)により測定が難しい場合も多かった。また本方法で定量できるアポトーシスが発現する照射線量も明らかでかなったため、今回は、X線照射時に本法で定量可能な条件(照射線量など)を求めるための実験を中心に行い、いくつかの細胞で至適条件が求められたにとどまった。今後は今回求められた実験条件を元に、重粒子線照射時のアポトーシスの発現頻度の定量を試み、重粒子線の殺細胞効果および遺伝子突然変異発現とアポトーシス発現の関連を検討する予定である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】2,500千円 (直接経費: 2,500千円)