【研究領域課題番号】18H03981 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

１分子計測（SMD） / ナノバイオ / 磁気ピンセット / 新生鎖 / ストレス応答 / １分子計測 / 温度生物学 / 翻訳アレスト / 光ピンセット / １分子計測（SMD)

【研究成果の概要】

翻訳制御に関する研究を行い、以下の成果を得た。（1）蛍光標識したpre-miRNAを培養細胞にインジェクションし、miRNAの動態を蛍光相関分光法と１分子イメージング法で解析した。１分子のmiRNAが細胞骨格に沿って運動する様子が観察された。（2）SecM、mRNA、リボソームからなる翻訳アレスト複合体をカバーガラスと磁気ビーズに結合させ、負荷を加えた。その結果、負荷依存的に翻訳アレストが解除されることを明らかにした。（3）ストレス顆粒内のmRNAを蛍光標識して超解像顕微鏡観察した。ストレス顆粒内にはmRNAが高密度で存在している領域と低密度で存在している領域があることを発見した。

【研究の社会的意義】

DNA に蓄えられた遺伝情報は一時的にmRNA にコピーされ、リボソームによってタンパク質に翻訳される。翻訳の制御は、生命活動の根幹に関わる重要なプロセスであり、その制御機構を分子レベルで理解する必要がある。本研究は、新たな遺伝子発現制御機構として注目されているRISCの形成機構、ストレス顆粒の形成と維持機構、翻訳アレストの分子機構について新たな知見を得ることに成功しており学術的な意義がある。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】44,070千円 (直接経費: 33,900千円、間接経費: 10,170千円)

【研究分野】ナノバイオサイエンス

【研究領域課題番号】16K13645 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオセンシング / ナノポア / 相変化材料 / DNA / 金ナノ粒子 / １分子計測 / ナノバイオ / 半導体物性 / 流体工学

【研究成果の概要】

ナノポア技術への期待はシーケンサ応用にとどまらず、分子・粒子識別、タンパク分子解析や細胞観察・遺伝子導入などに広がりつつある。本研究では、固体ナノポアに対してアクティブな制御機能を具備させることを目的とした。ナノポアを相変化材料で被覆し、結晶相・アモルファス相間の大きな光学的コントラストを利用することによって、ナノポア近傍に生じる対流、熱泳動を制御し、DNAやナノ粒子のナノポア通過過程のスイッチング機能を実証した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)

【研究分野】分析化学

【研究領域課題番号】16H04162 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA / 1分子計測(SMD) / ナノバイオ / イメージング / 細胞 / 蛍光プローブ / バイオイメージング / １分子計測(SMD)

【研究成果の概要】

本研究では独自開発したRNA標識技術mPUMテクノロジーを用いて、生細胞内RNAを1分子レベルから1細胞レベル、短時間の動態から長時間の可視化解析までを実現する分子ツール群の開発を目指した。1分子レベル・短時間の動態観察では二分割緑色蛍光タンパク質を用いたプローブを作製し、テロメア反復配列含有RNA(TERRA)と染色体テロメア領域、テロメア関連タンパク質の同時1分子追跡を実現し、未知の機能モデル構築に至った。1細胞レベル・長時間RNA可視化検出プローブとしては、二分割発光タンパク質を用いたプローブを開発した。本プローブを用いて1細胞解像度で数10分間のβアクチンmRNA可視化検出を実現した。

【研究の社会的意義】

近年様々な細胞生理機能について、RNAの動態や局在の直接関与が知られている。一方生細胞内RNAの動態・局在の可視化解析法は極めて限られていた。また、RNAは遺伝子発現の一次産物であり、生細胞内RNAの可視化定量法開発はすなわち非破壊的な遺伝子発現解析法の創出と言える。本研究では独自に構築したmPUMテクノロジーを用いて、1分子解像度での生細胞内RNA動態解析から、数10分間にわたる1細胞解像度RNA可視化定量法を構築した。すなわち本研究の成果により、生細胞内のRNA機能について1分子単位・秒単位の現象から細胞ごとに特徴が現れる長時間の遺伝子発現までを可視化解析する分析技術群の構築が実現した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】18,070千円 (直接経費: 13,900千円、間接経費: 4,170千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】15H04358 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

１分子計測（SMD） / ナノバイオ / 蛋白質 / １分子計測（SMD) / 光ピンセット / リボソーム / １分子生理学・生化学 / １分子イメージング / ナノ計測 / １分子計測(SMD)

【研究成果の概要】

１．蛍光標識したmiRNA前駆体を細胞内にマイクロインジェクションし、内在性の生合成経路によりRISCに取り込ませた。ゴルジ体を中心にアクチンフィラメント上を動くmiRNAを１分子イメージングできた。
２．Cy5標識アンチセンスプローブを用いてストレス下の細胞内mRNAの局在を超解像イメージングした。ストレス顆粒（SG）内でmRNAは均一に存在するのではなく、直径約100 nmの高密度領域を形成していた。
３．SecMのリボソーム外の領域を部分的に欠損させた変異体の翻訳アレストの寿命を測定した。57-73と57-98番目のアミノ酸が翻訳アレストの安定化に寄与していた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】16,120千円 (直接経費: 12,400千円、間接経費: 3,720千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】25251016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

1分子生物物理 / ナノバイオ / ATP合成酵素 / 生体エネルギー / マイクロチャンバー / 1分子計測 / 表面プラズモン / 膜チャンバー / トランスポーター / 1分子計測・操作 / 分子モーター / ＡＴＰ合成 / 表面増強ラマン / 1分子観察

【研究成果の概要】

F1-ATPaseの分子機構に関し大きな進展があった。細胞内制御に係わる阻害状態への遷移する機構の解明に加え、加水分解とリン酸解離の角度が異なることを明らかとした。また、ATPのリン酸部部分との相互作用がトルクに直接寄与することを明らかにした。ナノロッドの異方性散乱を用いた超高速1分子計測技術を確立し、F1に加えキネシンの新しい反応中間体を発見することに成功した。また、超微小リアクタを脂質二重膜でシールした膜チャンバー技術を開発し、1分子のATP合成酵素のプロトン輸送活性測定に成功した。以上の通り、ATP合成酵素に関する根源的理解を進め、普遍的な新しい1分子計測技術を確立した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】47,060千円 (直接経費: 36,200千円、間接経費: 10,860千円)

【研究分野】電子デバイス・電子機器

【研究領域課題番号】25289096 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

Microfluidics / Lab-on-a-chip / MEMS / NEMS / Bionanotechnology / Single-molecule / ナノ流体システム / ナノフルイディクス / 電気二重層 / 単一分子計測 / 電気計測 / lab-on-a-chip / バイオセンシング / 先端計測デバイス / ナノバイオ / マイクロ・ナノデバイス / 1分子計測 / バイオナノテクノロジー / 電気インピーダンス計測 / ナノデバイス / 極微空間 / 超高感度測定 / Nanochannel / Nanogap / Hydrated diameter / Electrokinetic / MicroTAS / Nanobiology

【研究成果の概要】

電気インピーダンス計測によりナノ流路内のイオン分布と輸送現象を評価した。その結果，流れがある場合，流れが無い状態に対して電気二重層の厚さが薄くなるという結果を得ることが出来た。さらに，電気二重層がオーバーラップする程に細いナノ流路内では，表面電荷を打ち消すカウンターイオンでナノ流路内が占められていると考えられ，Grahameの式で見積もった表面電荷量をDebye-Huckel-Onsager式にフィードバックして抵抗値に換算したところ，ナノ流路表面の表面電荷に制限された抵抗値が得られ，低濃度側における電気二重層のオーバーラップ状態の抵抗値と非常に良く一致することを明らかとした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2017-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】24227005 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

走査プローブ顕微鏡 / 1分子計測・操作 / バイオイメージング / タンパク質 / 細胞 / ダイナミクス / AFM / 走査型イオン伝導顕微鏡 / 構造生物 / １分子計測・操作 / 1分子計測 / 生物物理 / ナノバイオ / 生体分子 / 原子間力顕微鏡 / 高速AFM / イメージング / 細胞内オルガネラ / 機能動態

【研究成果の概要】

三つの課題に取り組んだ。課題1では、既に確立した高速AFMを利用して多様な蛋白質系で起こる動的プロセスを観察し、機能メカニズムに迫るとともに、従来技術では困難な天然変性蛋白質の構造解析が高速AFMで可能であることを実証した。課題2では、振動を起こさずに広域を高速走査する技術やイメージング中に試料を操作可能なインターラクティブ高速AFMを開発し、その有効性を実証した。また、カンチレバー走査方式の高速AFMと蛍光顕微鏡との複合機を開発し、蛍光像と高速AFM像の同時取得を実現した。課題3では、非接触観察可能な走査型イオン伝導顕微鏡の高速化に向け要素技術を開発し、約100倍の高速化に成功した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2012-05-31 - 2017-03-31

【配分額】215,540千円 (直接経費: 165,800千円、間接経費: 49,740千円)

【研究分野】ナノ材料・ナノバイオサイエンス

【研究領域課題番号】22241032 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

1分子イメージング / ナノ計測 / １分子計測 / 放射光 / ナノバイオ / X線 / 1分子計測 / X線集光 / 分子内運動

【研究成果の概要】

2000年に大型放射光施設を用いたX線1分子追跡法(DiffractedX-rayTracking:DXT)を提案し、それ以来、ポリマーやDNA分子、抗原抗体反応、そして機能性膜タンパク質と分子内運動をマイクロ秒からミリ秒レベルで、かつピコメートルという超高精度で高速1分子計測してきた。この高精度1分子追跡法を実験室レベルで計測可能とする装置開発を行い汎用的手法として確立させることが本研究の目的である。実現のための技術的ポイントは3つある。直径100-800nmサイズの完全ナノ結晶作製技術の確立、デモ的な実験室レベルX線光源として放射光施設を用いての高効率集光化、そして、究極的信号バッググラウンドの低減対策を放射光施設で実現した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】44,980千円 (直接経費: 34,600千円、間接経費: 10,380千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】21370065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

1分子計測 / ナノバイオ / 分子機械 / 生物物理 / 分子計測 / 光ピンセット

【研究成果の概要】

1分子のリボソームとmRNAからなる翻訳の初期過程にある複合体の破断力を光ピンセットにより測定した。その結果、IF2は最終的に形成される70S翻訳開始複合体を安定化することで、効率的な翻訳開始に寄与していることが明らかになった。次に、シャペロニン反応サイクルを解析した。GroELは2つのリングを交互に利用しながら反応サイクルを進行させていると考えられていた。しかし、高濃度の変性タンパク質が存在する場合、GroELの両側のリングにGroESが2個同時に結合した複合体が形成されることが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】18,850千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 4,350千円)

【研究分野】ナノ材料・ナノバイオサイエンス

【研究領域課題番号】20510114 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

1分子イメージング / ナノ計測 / 1分子操作 / ナノ流体デバイス / 電気インピーダンス測定 / マイクロ化学システム / MEMS / NEMS / 1分子科学 / 分子操作 / ナノ界面・表面 / ナノバイオロジー / 1分子・ナノ計測 / 1分子計測 / マイクロ・ナノデバイス / ナノバイオ / システムオンチップ

【研究成果の概要】

本研究は,幅や高さが数10nmサイズのナノ流路を利用して,生体分子を1分子ずつ検出する1分子センシングデバイスを実現するために必要な要素技術の開発を目的としてスタートした。その結果,ナノ流路内でfAオーダーの感度を持つ電流計測系の構築に成功し,ナノ流路内での超高感度電流測定から,ナノ流路を流れるDNA1分子の検出に成功した。さらに,オンチップ型のfA級電流測定回路の集積化にも成功し,集積化1分子計測ナノ流体システムの構築を一歩進めることに成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】生物物理・化学物理

【研究領域課題番号】20740238 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生物物理 / ミオシン / 1分子計測 / 筋肉 / スティフネス / 骨格筋ミオシン / ナノバイオ

【研究成果の概要】

生体内環境に近い多分子が共存するフィラメント上における、骨格筋ミオシン1分子の力学特性を捉える事を試みた。ミオシン1分子のスティフネスを計測し、ミオシンの硬さには異方性があることを示した。力を出す方向に引っ張ると硬くなって力を出し易く、反対方向に押すと紐のように柔らかくなり、反発力を軽減する機構があることがわかった。この計測から、筋肉の中で力を出し終えたミオシンが、他の分子の力発生の妨げになることを回避するための巧みな1分子力学特性があることが判明した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2008 - 2009

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】マイクロ・ナノデバイス

【研究領域課題番号】17201031 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

1分子計測 / 生物物理 / ナノバイオ / マイクロ・ナノデバイス / μTAS / セルソーター

【研究成果の概要】

微小流路をチップ上に作製し、蛍光標識した生体試料を蛍光顕微鏡にて高感度に検出し、温度感受性ハイドロゲルをレーザー局所加熱にて制御し、生体試料溶液を高精度に流し分ける技術の開発を行った。その結果、1個の量子ドットに結合した生体分子を高感度に検出し、3msの時間分解能で分離することに成功した。また、石英ガラス基板に金属薄膜を約100nm蒸着し、これに100nmの開口を開けてエバネッセント場を発生させた。このナノ開口を用いてシャペロニンGroELとGroESの結合と解離を観察した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2005 - 2008

【配分額】49,790千円 (直接経費: 38,300千円、間接経費: 11,490千円)