【研究分野】実験動物学

【研究領域課題番号】14380383 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

グリーンマウス / グリーンラット / レッドマウス / 着床 / キメラ / MAPC細胞 / 異種胚キメラ / ジフテリアトキシン / Creリコンビナーゼ / トランスジェニックマウス / loxP / 骨髄細胞 / 幹細胞 / GFP / 異種移植 / ラット / マウス / 妊娠

【研究成果の概要】

異種胚生着の目標の一つは、臓器移植などに使用できるような臓器を異種の動物に作らせることである。そのために必要なことは、目的の臓器を欠損した動物と、その臓器以外が欠損するような動物を組み合わせることにある。異種キメラにおいて片方の胚に由来を限定する方法について検討を行った。
即ち、ジフテリアトキシンをLoxP配列で挟んでおき、Creリコンビナーゼが働いたときにだけ毒素遺伝子が転写されるようにしくんだトランスジーンを作製した。ついでこのトランスジーンをもつトランスジェニックマウスを作製し、現在ひとつのラインを樹立した。さらにこのラインのほかに臓器特異的に発現するCreリコンビナーゼとして、精子が産生されるときにのみ働くプロタミンのプロモーターを用い、その制御下にCreリコンビナーゼを発現するようにしたトランスジーンをもつ別のトランスジェニックマウスを作製した。このように作製したジフテリアトキシンをもつトランスジェニックマウスと、Creリコンビナーゼをもつマウスを交配して、得られる産子に初期の目的どおりのフェノタイプが現れるか否かを検討したところ、計画通りに精子を欠損する不妊のマウスが得られた。このことからわれわれの設計どおりに、一部の臓器のみを欠損させる動物をデザインどおりに作製できることが示された。
またキメラマウス作製の過程で雌雄キメラを作製し、一個体内における雌雄細胞の分布やその運命について検討を加え、雄に分化した個体の中では雌の細胞も精原細胞になることを見出すとともに一部雌細胞は精巣の中で卵子に分化できることを示し生殖細胞の性の分化に関する基本的な仕組みを明らかにするとともに、異種キメラによる生殖細胞の作出のための基礎データをえることができた。
これらの研究を通じて異種キメラ作製法を基本にした臓器移植の基礎データをかためることができた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】16,000千円 (直接経費: 16,000千円)

【研究分野】血液内科学

【研究領域課題番号】14657241 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

造血幹細胞 / 可塑性 / ヒトES細胞 / 血球細胞 / Tie2 / GFP / 再生医療 / 幹細胞 / 再生医学 / Notch / paraaortic-splanchnopleura(P-SP)領域 / 血管内皮細胞

【研究成果の概要】

GFPトランスジェニックマウス造血幹細胞分画を移植して、脳内からGFP陽性細胞を採取し、神経特異的マーカーであるNeuNやTrk-Rの発現を解析した。この実験では、脳内においてGFP陽性細胞を同定することができ、これらの細胞におけるNeuNおよびTrk-Rの発現を確認した。しかしながら、その発現時期を明確にすることはできなかったため、これらの分子の発現を誘導する転写因子の道程には至らず、したがって遺伝子発現プロファイルを解析し、幹細胞可塑性の分子メカニズムを解明するという当初の目標に到達することはできなかった。
しかし一方申請者らは、科学技術・学術審議会「特定胚及びヒトES細胞研究専門委員会」において、ヒトES細胞の研究計画について審議を受け、平成14年12月に文部科学大臣からの計画承認を受けた。その後、ヒトES細胞の培養に着手し、造血細胞をよりよく分化誘導する条件を検索している。現在までのところ、無血清条件で未分化状態を保ちながらヒトES細胞を維持できているが、血球細胞への分化については血清添加条件でのみ成功している。これと同時に、マウスES細胞を用いて、ES細胞から造血幹細胞への分化を決定する分子を、発現クローニング法により同定を試みている。すなわち、ES細胞にTie2プロモーターでドライブされるGFP発現ベクターを導入し、GFP陽性をESから造血幹細胞への分化方向中胚葉マーカーとして用いる。マウスAGM由来cDNA発現ライブラリーをOP-9ストローマ細胞に導入し、ES由来GFP発現細胞の出現を指標として、cDNAを単離することを試みる。このようにして、別な角度から再生医療への道筋を見いだしたいと考えている。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2002 - 2003

【配分額】3,300千円 (直接経費: 3,300千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】12470149 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

LIF / 心筋梗塞 / プラスミド / 心臓リモデリング / VEGF / GFP / 骨格筋 / 共培養 / アポトーシス / 血管新生 / 骨髄細胞 / 遺伝子治療 / 幹細胞 / 心筋細胞 / 骨格筋細胞 / ANP / GATA / 心不全 / 心筋細胞分化 / BMP / TAK / Smad / ATF-2

【研究成果の概要】

leukemia inhibitory factor(LIF)の心臓に対する作用をマウスの心筋梗塞モデルを用いて検討した。心筋梗塞後のマウスの下肢にLIFのプラスミドを筋肉内注射したところ、2日後より血液中のLIF濃度は増加し、その後4週間後まで持続した。心筋梗塞を作成してから2週間後に心臓を評価した。LIFプラスミド注射群(LIF群)ではコントロール群に比べ、心筋梗塞後の心機能の低下や心臓リモデリングは軽減していた。梗塞境界領域での心筋細胞のアポトーシス数もコントロール群に比べLIF群で減少していた。LIF群ではVEGFの発現の亢進と血管内皮細胞の増加が認められたことより、LIFによる血管新生が心筋細胞のアポトーシスを減少させている可能性が示唆された。増殖している細胞の核で発現するKi-67蛋白の抗体で免疫染色をおこなったところ、LIF群では梗塞境界領域でKi-67陽性の心筋細胞が認められた。次にGFPトランスジェニックマウスの骨髄細胞を野生型マウスに移植し心筋梗塞を作成して解析をおこなった。LIF群ではコントロール群に比べ2週間後の梗塞境界領域におけるGFP陽性細胞数が増加していた。さらにこのGFP陽性細胞が心筋細胞や血管内皮細胞であることを確認した。今回の研究でウイルスベクターを使わなくとも、プラスミドの筋肉内注射のみで有効な治療効果が得られることも明らかとなった。
骨格筋内に心筋細胞へ分化可能な細胞が存在するか否かを検討するため、GFPを過剰発現するマウスの骨格筋由来細胞を単離し、1)新生仔ラットの心筋細胞と共培養、2)骨格筋由来細胞の単独培養、3)心筋細胞と培養液のみ共有するdouble chamber法による共培養、の3通りの方法で培養した。培養5日後に免疫細胞染色法により心筋特異的トロポニン、ANP、GATA4、cadherin、connexin43の発現を比較検討した。その結果、両者の細胞が互いに接することが可能な共培養下においてのみGFP陽性細胞の一部にトロポニン、ANP、GATA4の発現が認められた。また骨格筋由来細胞と心筋細胞との細胞間接着部位にcadherinとconnexin43の発現が認められた。これらの結果から骨格筋内に心筋細胞に分化可能な細胞が存在することが明らかになった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】14,900千円 (直接経費: 14,900千円)