【研究分野】応用動物科学

【研究領域課題番号】09760250 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

インスリン様成長因子^I / チロシンキナーゼ / 情報のクロストーク / cAMP / インスリン様成長因子I / differential display / cAMP経路 / 情報伝達

【研究成果の概要】

ラット甲状腺由来細胞FRTL-5細胞は、甲状腺刺激ホルモンであるTSHまたはcAMP情報伝達系を活性化する薬剤で長時間前処理した後IGF-Iで処理することにより、それぞれを単独で処理した場合に比べて相乗的にDNA合成が増強される。またこのTSHによるいわゆるprimingは、1)チロシンキナーゼに対する特異的な阻害剤であるgenisteinによって阻害される、2)DNA合成の阻害剤であるcyclohexymideによって阻害される、3)TSH処理に依存してチロシンリン酸化の増加するタンパク質が細胞内に存在する、ことから、cAMP経路の長時間の活性化によってあるチロシンキナーゼが合成され活性化されて、primingに重要な機能を果たしている可能性が考えられた。
本研究はラット甲状腺由来細胞FRTL-5細胞を用いてcAMP刺激によって発現量または活性の変化するチロシンキナーゼ遺伝子のクローニングを目的としている。cAMPのアナログであるBt_2cAMPで長時間処理した細胞と処理していない細胞とから抽出したRNAを鋳型とし、チロシンキンナーゼで保存されたアミノ酸配列から作製されたプライマーを用いてRT-PCRを行い、チロシンキナーゼ遺伝子のクローニングを試みた。その結果、現在までに既知のチロシンキナーゼが10種類単離された。このうち、JAKlおよびp56tckに対して特異的なプライマーを作製し、定量的RT-PCRを行うと、p56tck遺伝子の転写量がcAMP刺激により顕著に増加することが示された。今後、この遺伝子に関してcAMP処理によるタンパク質量、活性化量の変化についても検討を加えていきたい。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09878164 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エリスロポエチン / JAK2 / STAT5 / SH2ドメイン / りん酸化 / 情報伝達 / チロシンキナーゼ / 分化

【研究成果の概要】

我々は赤芽球様細胞ELM-1を用いてエリスロポエチン(EPO)による赤血球分化の研究を行っている。この細胞はEPOによりヘモグロビン陽性にまで成熟し、IL3はそれ自体では分化は誘導しないもののEPOによる赤血球分化を促進する。我々はEGF受容体とEPO受容体のキメラ分子を作成し、さら受容体のチロシン残基に変異を導入することで受容体細胞内ドメインの2つのチロシン残基(Y343、Y401)のいずれかが赤血球分化に必須であることを証明した。これら2つのチロシン残基はSTAT5の活性化に必要であり、STAT5と分化は密接に関連していることが考えられた。しかしながらIL3受容体やプロラクチン受容体とのキメラ作成して本細胞に導入したところ、これらのキメラ分子はSTAT5を活性化するもののこの細胞の赤血球分化は誘導しないことを明らかにした。したがってIL3受容体になくEPO受容体に特異的な分化シグナルが存在し、STAT5とともに分化の促進に働くと考えのが自然であろう。そしてそのシグナルの発生にはEPO受容体Y343、Y401のいずれかのりん酸化が必要であることが示唆される。現在この2つのリン酸化チロシン残基と会合する情報伝達分子をクローニングすべくりん酸化ペプチドによる精製と酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行っている。またJAK2の新しい基質となりうる分子APS(adaptor contatining PH and SH2 domain)をクローニングしており今後エリスロポエチンシグナルにおける役割を明らかにしたい。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1997

【配分額】2,100千円 (直接経費: 2,100千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】09044349 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

JAK / STAT / サイトカイン / SH2ドメイン / チロシンキナーゼ / トランスジェニックマウス / ノックアウトマウス / ユビキチン / りん酸化 / 情報伝達 / CISファミリー

【研究成果の概要】

サイトカインは受容体の細胞内ドメインに会合するJAKチロシンキナーゼを介して細胞内にシグナルを伝える。STATはそのシグナルを核へ伝える重要な転写因子のひとつである。
一方サイトカインシグナルを負に調節するメカニズムやサイトカイン間のクロストークの分子レベルでの解明も進んできている。われわれはSTAT5の負のフィードバック調節因子であるCIS1,JAKキナーゼの阻害因子であるJABをクローニング、さらにこれらを含むCISファミリーの存在を明らかにした。本研究では培養細胞を用いて、CISは受容体に結合することでSTAT5を抑制し、JABおよびCIS3は直接JAKのチロシンキナーゼドメインに会合しその活性を抑制することを明らかにした。CIS3,JABのノックアウトは完成しており現在解析中である。次にJABおよびCIS3のJAKシグナル抑制の分子機構を明らかにするために欠失変異や両者で保存されているアミノ酸に様々な点変異を導入し構造活性相関を行った。その結果JAB,CIS3のSH2ドメインはJAK2のactivation loopに存在するY1007にSH2ドメインを介して結合することを発見した。しかしJAK活性化抑制にはSH2ドメインだけでは不十分で近接したアミノ酸約12個の部分が必須であり、この部分はJAB,CIS3でよく保存されている。この領域をキナーゼ阻害領域と名付けた。またこのN末端部分がないとJAKへの結合力が極端に落ちることからJAB,CIS3はSH2ドメインでactivation loopと、さらにN末端部分でJAKの活性中心に結合していると考えられる。がんで重要な働きをするチロシンキナーゼの阻害因子の分子機構が明らかにされた意義は大きい。CIS1はサイト力イン受容体に会合するがそれだけでSTAT5の活性化を抑制できるかどうか不明である。我々はフランスのグループとともにCIS1がユビキチン化されすみやかに分解を受けることを見い出した。チロシンりん酸化されたSTAT5もまたユビキチン化によって分解されることが知られており、CIS1が何らかの機構でSTAT5の分解を促進している可能性が考えられる。今後阻害の分子機構をより詳細に解明したい。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】7,900千円 (直接経費: 7,900千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】09470036 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

チロシンキナーゼ / JAK / STAT / CIS / ノックアウトマウス / サイトカイン / エリスロポエチン / 胎児造血 / エリスポエチン / エリスロポエチン受容体 / シグナル伝達 / 細胞分化 / SH2ドメイン / りん酸化 / 情報伝達 / CISファミリー

【研究成果の概要】

赤血球造血の制御機構を解明するために我々は造血幹細胞に特異的に発現する遺伝子の解析を行った。まず骨髄細胞をセルソーターにて造血幹細胞を分画し、この細胞集団からPCR増幅を経てcDNAライブラリーを作成した。これを酵母two-hybrid用のベクターに組み込み、c-kitをbaitとしたスクリーニングを行った。その結果STAP-1と呼ぶ新規遺伝子をクローニングした。この遺伝子はPleckstrin homology(PH)ドメイン,Src homology 2(SH2)ドメインを有するアダプター分子でc-kitによってチロシンりん酸化された。RT-PCRの結果、STAP-1の発現はc-kitを有する骨髄細胞に限局することが明らかとなった。また最も高い発現はCD34 low/-Sca-1+c-kit+Lin-の幹細胞分面に得られた。現在生化学的な解析を行っている。
次にエリスロポエチン受容体からのシグナルを制御する分子として、我々がクローニングしたCIS3の機能解析を行った。CIS3は胎児肝臓の赤芽球前駆細胞に強く発現していた。生理機能を明らかにするためにノックアウトマウスを作成した。CIS3-/-ノックアウトは胎性致死であり、受精後12日以前は野生型と大きな形態の差はないが12.5-15日胚では全身での出血が見られた。また特に肝臓では構造が崩れており有核の胎児型赤血球で充満していた。胎児肝細胞をEPO存在下で培養すると野生型マウスにくらべてはるかに大きなBFU-E(前期赤芽球前駆細胞)コロニーが形成された。また赤芽球前駆細胞においてCIS3とJAK2の会合が確かめられた。したがってCIS3は胎児造血幹細胞においてEPO/JAK2シグナルを負に調節する因子であることが示された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】13,400千円 (直接経費: 13,400千円)

【研究分野】応用微生物学・応用生物化学

【研究領域課題番号】08044193 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

IGF-I / IGFBP / IGF-Iレセプター / トロピックホルモン / cAMP / チロシンキナーゼ / 細胞増殖 / 細胞分化 / IGF-1 / IGF-1レセプター / IRS / 情報伝達 / IGF-BP / ICFBP / ICF-1レセプタ

【研究成果の概要】

インスリン様成長因子(IGF)は、多くの組織・細胞の成長・分化に必須であることが広く知られている。最近になり、IGFやこのレセプターの遺伝子を過剰発現あるいは欠失させた動物を用いた解析より、IGFの生理活性が、時期特異的かつ組織特異的に合目的的に制御され、はじめて正常な発達・成長が可能となることが示されてきている。そこで、本研究では、IGFの生理活性調節機構の詳細を細胞外および細胞内情報伝達の観点から明らかにすることを目的とした。まず、種々の栄養状態・種々のホルモン投与あるいは欠乏状態・手術後の動物などを用いて、色々な組織のIGFおよびIGF結合タンパク質(IGFBP)の産生量、および血中動態、IGFレセプター発現量などを解析した。その結果、これらが異なる様式で制御されており、細胞外の情報修飾機構を介して、それぞれの生理状態に応答したIGFの同化活性の厳密な制御が行われていることがわかった。一方、内分泌細胞をはじめとした種々の細胞で、トロピックホルモンなどの他のホルモン・成長因子とIGF-Iの相乗作用が観察された。特に、甲状腺細胞では、cAMP前処理により、細胞がよりIGF-Iに反応するようなpriming機構が存在していることを明らかとした。このような現象は、肝臓やその細胞などをインスリン刺激した際にも認められ、生体内で普遍的に起こっていると結論した。これら一連の結果は、IGFの生理活性の種類や強度は、細胞の種類により、あるいは生体の発達状態・生理状態や共存する他の因子により、(1)IGF生産、(2)IGFBP生産、(3)IGFsとIGFBPsの結合状態、(4)IGFsレセプター発現、(5)IGFsの細胞シグナル伝達などの段階で複雑に制御されていることを示している。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】13,200千円 (直接経費: 13,200千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】08680774 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカイン / JAK / SATA / チロシンキナーゼ / 転写因子 / SH2ドメイン / りん酸化 / 情報伝達

【研究成果の概要】

酵母two-hybrid系を利用してJAK2のキナーゼドメインと直接結合しうる分子をスクリーニングした。その結果新規遺伝子JAB(JAK-binding protcin)をクローニングした。JABは構造的にCIS(cytokine-inducible SH2 protein)に類似した分子であり、293T細胞を用いた実現ではJAK1,2,3およびTyk2どのJAK分子とも会合した。two-hybrid系ではCISはJAK2とは結合しなかった。またキナーゼドメインに変異を導入してキナーゼ活性をなくしたJAK2とは結合しなかったのでJABはSH2ドメインとJAK2の自己りん酸化部位を介して結合しているものと考えられた。次に293細胞においてJAK2を過剰発現させるとJAK2の自己りん酸化や基質であるSTATのりん酸化を検出できる。このときJABを共発現させるとJAK2の自己りん酸化やSTATのりん酸化が強力に抑えられることがわかった。ルシフェラーゼアッセイにおいてJABはSTAT3,STAT5の活性化を抑制した。またJABを安定に高発現させた繊維芽細胞はインターフェロンによる細胞増殖抑制効果にたいして耐性を示した。したがってJABはひろくJAK-STAT経路の負の調節因子と考えることができる。さらにデータベースの検索によってESTとして登録されているcDNAのなかにCIS,JABと構造的に類似する遺伝子が少なくとも3つ存在することが明かとなった(CIS2,3,4)。SH2ドメインは25-35%程度のアミノ酸が同一であり、他のSH2ドメインとは明かに異なったグループをつくる。さらにこのファミリーではC末端約40アミノ酸(CIS-homology motif ; CH motif)がよく保存されており機能的に重要と考えられる。このなかには保存されたチロシン残基が存在し、この領域がキナーゼのpseudesubstrateとして作用してキナーゼ活性を抑制するというモデルを考えている。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1996

【配分額】2,500千円 (直接経費: 2,500千円)