Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

GFP色素 / turn-on蛍光 / turn-on / 蛍光性分子ローター / 蛍光プローブ / GFP / 糖鎖受容体 / レクチン / 糖 / スクリーニング

本研究では、糖鎖受容体を始めとする受容体などの非酵素タンパク質へ適用可能なturn-on型蛍光プローブの探索手法の開発を進めている。通常状態では無蛍光であるが分子内回転が抑制された時に蛍光強度の上昇を示す蛍光性分子ローターとして、GFP色素誘導体を用いて研究を行っている。
本年度は、１）GFP色素誘導体の蛍光応答性の向上を目指し、蛍光の粘度応答性と構造の関係を調べる検討、２）turn-on型蛍光プローブの細胞への適用を目指し、糖を認識する膜タンパク質GLUTを標的とした蛍光イメージングを試みた。その結果、細胞膜上から強い蛍光シグナルが観察され、プレリミナリーながら細胞膜上でGLUTに結合して蛍光を示したことを示唆する結果を得た。
３）また、光親和性残基を導入しタンパク質と共有結合させて強固に分子内運動を拘束させるアジド修飾GFP色素誘導体について、蛍光強度をさらに増強できる誘導体の合成を進めた。
４）昨年度から引き続き、単純な構造の色素として粘度依存的蛍光応答を示すビアリール化合物を用いた新規蛍光色素骨格の探索から見出されたスルフィドとニトロ基を導入したビフェニル誘導体について検討を進めた。このものとグルコースとのコンジュゲート体を、GLUTを過剰発現しているPC-3細胞に作用させたところ、細胞膜上からは蛍光シグナルは見られなかったが、細胞内から蛍光シグナルが観測された。阻害実験において一定の割合で阻害がかかったことから、GLUTを介して細胞内に集積可能な蛍光プローブであることを見出した。このビフェニル誘導体については、蛍光と光増感能の両方を有しており、実際に光照射によるがんの殺傷効果も確かめられ、がんの光線力学診断や光線力学治療への適用が期待される(論文化済み、Bioorg. Med. Chem., 2022, highlighted as front cover)。

蛍光プローブ / 蛍光性分子ローター / スクリーニング / レクチン / in silico / ドッキングシミュレーション / 糖鎖受容体 / GFP色素 / turn-on / GFP / 糖 / 細胞間相互作用 / 有機合成

本研究では、糖鎖を介した細胞同士の相互作用の解明ための簡便なツール開発を目指し、糖鎖受容体に結合した際にのみ蛍光を示すプローブ開発を行った。本研究では、高粘度環境においてのみ分子内運動が抑制され蛍光を示す蛍光性分子ローターを用いた。蛍光性分子ローターを用いたプローブは無洗浄で使用できるため汎用プローブとなり得るが、タンパク質への結合に伴う微小な環境変化を蛍光応答に反映することが難しい。そこで、プローブをライブラリー化し、ライブラリーから高い蛍光応答を示すプローブを選別する手法を開発した。さらに得られたプローブの基本骨格に対して、in silicoスクリーニングを用いたプローブ探索を行った。

研究期間内において、蛍光応答を用いたスクリーニングによる標的レクチンに結合して蛍光を示すturn-on型蛍光プローブの探索法の開発に成功した。蛍光性分子ローターを用いたプローブは、標的結合時にのみ強い蛍光を示すため洗浄不要であり、原理的に細胞外のみならず細胞内のタンパク質検出にも使用可能な有用なプローブである。これまでの研究では、十分な蛍光応答を示す標的タンパク質は限られていたが、本手法を活用することで、リガンドとの結合力が弱いタンパク質に対してもプローブを設計できることが示された。さらなる手法の改善は必要であるが、今後生命現象に関わる多数のタンパク質の機能解析に応用可能であると期待される。