【研究領域課題番号】19KK0242 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

コウモリ / 疫学解析 / ウイルス / 細菌 / 寄生虫 / 遺伝子 / 抗体 / 疫学調査 / リスク分析 / 網羅的解析 / 病理解析 / 感染症 / 疫学 / 数理モデル

【研究成果の概要】

コロナウイルスやエボラウイルス、ニパウイルスなど、世界的に問題となっているウイルスの自然宿主としてコウモリは知られている。今後も、コウモリから新たなウイルス感染症が発生する可能性は否定できない。また、コウモリを介した細菌や寄生虫の拡散リスクについては情報が少ない。コロナウイルスについては、SARS-CoV-2関連ウイルスが日本を含む東南アジアに生息するコウモリから検出されていることから、令和3年度はコロナウイルスを中心に調査を行った。
フィリピンのルソン島北部にあるビアクナバト国立公園で捕獲されたコウモリ9種120匹から採取した血液、小腸及び腸管スワブを対象にリアルタイムPCR法及びRT-PCRによりコロナウイルスのゲノム検出を行うと共に、ELISAを用いてSARS-CoV-2特異的抗体の検出を試みた。リアルタイムPCRの対象領域はN領域、RT-PCRの対象領域にはORF1a、ORF1b、S 領域を設定し、N領域はSARS-CoV-2検出用リアルタイムPCR、ORF1a及びS領域はSARS-CoV-2検出用nested PCR、ORF1b領域はコロナウイルスを広く検出可能なconventional PCRを行った。
小腸サンプルを対象としたリアルタイムPCRでは3サンプルで陽性が確認されたが、RT-PCRでは遺伝子の増幅が確認されなかった。糞便サンプルについては、ORF1b及びS領域を対象としたPCRでは遺伝子の増幅は確認されなかったが、ORF1a領域を対象としたPCRでは120サンプル中52サンプルで遺伝子増幅が認められ、そのうち43サンプルで塩基配列が決定され、SARS-CoV-2と98%以上の相同性を示した。SARS-CoV-2特異的抗体は検出されなかった。今後、生態情報を含めた疫学解析を行い、コロナウイルスを保有するコウモリの特徴について明らかにしていく。

【研究種目】国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))

【研究期間】2019-10-07 - 2023-03-31

【配分額】18,200千円 (直接経費: 14,000千円、間接経費: 4,200千円)

【研究分野】応用薬理学

【研究領域課題番号】17H01547 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

麻疹ウイルスベクター / 遺伝子挿入 / キメラ抗原T細胞療法 / ナイーブT細胞 / 抗腫瘍効果 / Magnetタンパク / メチオニン分解酵素 / T細胞 / プラスミド / ウイルス / 遺伝子 / 応用微生物 / 免疫学 / がん / ウイルスベクター / 遺伝子治療 / T細胞療法

【研究成果の概要】

麻疹ウイルスベクター（MVV）は我々の研究チームが世界に先駆けて開発を継続し、標的細胞ゲノムへの遺伝子挿入がなされず細胞質内で増殖するため宿主細胞へのゲノム毒性がなく高安全で、一定期間内の導入遺伝子細胞質内高発現が可能な新規ウイルスベクターである。我々はMVVを用いてより効果的なキメラ抗原T（CAR―T）細胞療法開発を目的に低抗原性MVVの構築に成功した。さらに光制御性Magnetタンパクを用いた抗腫瘍活性の制御法ならびにメチオニン分解酵素遺伝子搭載CAR-T細胞療法の開発を行った。本研究成果に基づき、固形腫瘍に対する高効率で高安全性の第二世代CAR-T療法の開発が可能と考えられる。

【研究の社会的意義】

麻疹ウイルスベクター（MVV）は我々が独自開発し、世界で初めて高安全性のヒト人工多能性幹（hiPS）細胞樹立に成功すると共に、生体内での抗腫瘍免疫誘導に極めて重要であると考えられるナイーブT細胞に高効率で遺伝子導入できることを初めて発見した。本研究では臨床応用を前提にMVVの抗原性の減弱、光によるベクター増幅制御の可能化、メチオニン分解酵素遺伝子搭載の可能化、に関する技術開発を行った。本研究の学術的意義および新規性は高く、本方法の確立により、より効果的な難治性固形腫瘍に対する治療法の開発が可能になることが期待できることから、社会的貢献度も極めて高いものと考えられる。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】41,990千円 (直接経費: 32,300千円、間接経費: 9,690千円)

【研究分野】土木環境システム

【研究領域課題番号】15H04065 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ウイルス / 下水 / メタゲノム解析 / ゲノム解析 / シーケンシング / ゲノム / 遺伝子 / 次世代シーケンシング / 土木環境システム / ウィルス

【研究成果の概要】

本研究は効率的な新興病原ウイルスの発見に適した検出手法の開発を目標とした。下水中のウイルスゲノム群から解析対象のゲノムのみを選択的に回収し，次世代シーケンシング法によりその塩基配列を決定することで，下水中の存在量が低いウイルスであってもゲノム解析を可能にする手法を開発した。また，下水中のウイルスを対象としたメタゲノム解析を行い，得たほとんどの配列がデータベースに近縁配列がないことを確認した。メタゲノムで得た塩基配列で得た塩基配列をもとに，未知のウイルスによると考えられるコンティグを作成し，その配列を持つウイルスゲノムが国内下水に常在する可能性を示した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】18,200千円 (直接経費: 14,000千円、間接経費: 4,200千円)

【研究分野】ウイルス学

【研究領域課題番号】24790436 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エピジェネティクス / HIV-1 / HTLV-1 / 潜伏化 / ATL / ウイルス / 遺伝子 / シグナル伝達 / miRNA

【研究成果の概要】

1. HIV-1の潜伏化過程を可視化できる新たなレポーターを作成し、感染初期におけるLTRの制御機構を解析した結果、感染初期にウイルス遺伝子発現の異なる集団が同時に形成、維持されることを初めて実験的に証明した。さらに感染初期に集団の一部にpolycomb依存的な転写抑制が起こり、感染細胞集団の不均一性を成立させていることがわかった。
2. ATL細胞、Tax発現T細胞及び正常T 細胞におけるH3K27me3及びH3K4me3のメチル化パターンを網羅的に解析した。ATL細胞は休止期T細胞と比べてH3K27me3の蓄積が顕著であり、またTaxの発現はATL細胞で見られるメチル化異常の一部を再現した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】応用昆虫学

【研究領域課題番号】22380033 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バキュロウイルス / 非コード RNA / カイコ / 昆虫ウイルス / 病原性 / 非コードRNA / 昆虫 / 発現制御 / 遺伝子 / 転写 / ウイルス

【研究成果の概要】

昆虫ウイルスの一種であるバキュロウイルスは、100kbp以上の2本鎖DNAをゲノムとして持つ大型のDNAウイルスであり、高度な宿主制御を行うことが知られている。バキュロウイルスゲノムには100個以上のタンパク質コード遺伝子が存在するが、一部のグループが提唱しているmicroRNAをのぞいて、非コードRNAの存在は知られていない。申請者は、ウイルス感染培養細胞のトランスクリプトーム解析によって、既報のORFをコードしない長鎖非コードRNAがウイルスゲノムから転写されていることを発見した。バイオインフォマティクス解析により100個以上の非コード転写ユニットを同定し、そのうちの一部は、遺伝子ORFの5'端にクラスターをなしてマップされたことから、ORFの転写制御に何らかの役割を果たしていると考えられた。さらに、発現量が多い転写物に関して、ノザンブロット解析を行うとともに、プロモーターノックアウトウイルスの作成を行った。現在までに13種類の変異ウイルスの作成に成功しているが、それらのほとんどが、野生株と比較して、ウイルス増殖に異常が認められた。以上のことから、バキュロウイルスのゲノム中に存在する長鎖非コードRNAはゲノムからリークした単なる転写産物ではなく、「機能性」RNAとして存在していることが判明した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】脳神経外科学

【研究領域課題番号】22390284 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経疾患 / 遺伝子治療 / AAVベクター / 脳神経疾患 / ウイルス / 遺伝子

【研究成果の概要】

脳神経疾患に対する新規治療蛋白質補充療法の開発に向け、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターやその産生細胞を用いた脳組織への新規薬物送達システム基盤技術開発を推進した。従来のベクター精製における密度勾配超遠心操作はGMP生産やSOP管理の観点で不利であったが、イオン交換やゲル濾過クロマトグラフィーを応用し、超遠心操作の省略に成功した。純度の高いベクターを応用することで、脳組織への遺伝子導入や脳神経疾患の治療実験において、安全に効果的な遺伝子導入が可能であった。また、ベクター産生型腫瘍標的細胞の開発に向け、体性幹細胞へのベクターコンポーネント導入条件を確認した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010-04-01 - 2015-03-31

【配分額】14,950千円 (直接経費: 11,500千円、間接経費: 3,450千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】19590796 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝細胞癌 / 血管新生抑制 / 遺伝子治療 / flk-1 / VEGF / 骨髄細胞 / 平滑筋前駆細胞 / 血管内皮前駆細胞 / 遺伝子 / 移植再生医療 / ウイルス / Soluble flk-1

【研究成果の概要】

マウス骨髄細胞を培養し血管内皮前駆細胞(EPC)平滑筋前駆細胞(SMPC)への分化を証明した。EPCもSMPCも皮下に肝癌細胞を接種して作成したマウスに尾静脈から投与すると選択的に腫瘍組織へ遊走しその一部は血管内皮細胞や周細胞へ分化した。SMPCにアデノウイルスベクターを用いて可溶性flk-1 cDNAを遺伝子導入し担癌マウスに投与すると腫瘍組織での血管新生が抑制され腫瘍の増大もわずかではあるが抑制された。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】19591504 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

トランスレーショナルリサーチ / ウイルスベクター / 遺伝子治療 / 細胞療法 / 樹状細胞 / 免疫学 / トランスレーショナル・リサーチ / ウイルス / 遺伝子

【研究成果の概要】

ウイルスベクターを介してサイトカイン等の治療遺伝子を導入した樹状細胞は癌免疫療法の画期的な手法になると考えられているが、臨床試験薬としての遺伝子導入樹状細胞の品質を定めた公的な基準は存在せず、各実施機関の判断に任されているのが現状である。そこで我々は最終産物である遺伝子導入樹状細胞の品質評価システムの開発を目的として、原料となるベクターと細胞のそれぞれの品質・安定性を明らかにし、その結果をふまえた遺伝子導入樹状細胞調製法の検討を行った。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2007 - 2008

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】土木環境システム

【研究領域課題番号】18206056 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

水の安全 / 病原微生物 / ウイルス / 遺伝子 / 指標微生物 / 紫外線 / 銀 / 消毒 / 上水道 / ミクロキスティン / レジオネラ / 大腸菌 / PCR / 安全性 / 光回復 / RNA

【研究成果の概要】

総合的な病原微生物対策のために必要ではあるが未解決の課題群に取り組み、以下の成果を上げた。
紫外線照射により不活化した大腸菌の海水中での挙動を解明するため、NaCl 溶液、MgCl2溶液、CaCl2 溶液中における光回復の程度を調べた。その結果、全ての溶液中で、高い塩濃度では光回復が抑制された。光回復抑制の機構は、細胞膜内外における陽イオンの電位差が浸透圧を生み出し、光回復酵素の生成が阻害されたからだと考えられる。
紫外線消毒の効率を上げるための試みとして、銀の併用によるウイルスの不活化効果の測定を行った。銀イオン0.05ppm 存在下における低圧紫外線による不活化では、大腸菌およびファージQβは銀存在下で不活化速度が大きくなり紫外線と銀の相乗効果が見られるが、ポリオウイルスおよびマウスノロウイルスに対しては銀の影響は見られなかった。
湖沼等において発生する藍藻類の異常増殖を抑制する新たな手法としての中圧及び低圧の紫外線照射処理において、藍藻類が生産する毒素ミクロキスティンの放出に関する研究を行った。その結果、紫外線照射によって藻類が破壊される影響よりも藻類が減少する影響が卓越し、水中のミクロキスティン濃度の上昇が抑制されることを見出した。
水道の給配水管路等において形成される生物膜などで増殖するレジオネラ属菌およびシュードモナス属菌に対して、銀を用いた消毒を試みた。その結果、菌体あたりに吸着する銀の量をパラメータとすることで消毒効果を定式化することが可能であることを見出した。
ウイルス粒子の選択的な濃縮を行う手法としてMgを用いる方法が適していることが分かった。また、ノロウイルスの塩素消毒耐性は他の腸管系ウイルスと同等以下であり、十分な塩素消毒が施された配水システムにおいてはノロウイルスが感染力を保ったまま末端給水栓まで到達する可能性は低いことが示唆された。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】49,790千円 (直接経費: 38,300千円、間接経費: 11,490千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】18591845 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮頸癌 / 細胞診 / コルポスコープ / siRNA / BACライブラリー / P16, in situhybridization / パピローマウイルス / ラマン分光 / 子宮頸部 / コルポスコピー / パビローマウイルス / 遺伝子 / ゲノム / マイクロアレイ / ウイルス / 癌

【研究成果の概要】

子宮頸癌の診療技術の改良に役立つ方法を研究した。診断では子宮頸癌をリアルタイムに診断する方法としてラマンコルポスコープの開発に着手した。従来にない斬新的なアプローチで再現性のあるデータを得ることができた。細胞診では従来、炎症所見の一つといわれているamphophiliaがHPV18型感染に特徴的な細胞像であることがわかった。細胞診検体を利用し、P16細胞免疫染色、HPV型判定、およびHPVのDNAに対するin situ hybridizationを施行し、分子生物学的にハイリスク症例を抽出することが可能となった。BACマイクロアレイにより遺伝子異常をゲノムワイドに網羅的に解析し、新たな癌関連候補遺伝子領域をみつけた。
一方、治療ではHPV18型に対するsiRNAを用い、HPV E6,E7遺伝子発現を制御し癌細胞の増殖を抑制することができた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2008

【配分額】4,100千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 600千円)

【研究分野】外科学一般

【研究領域課題番号】17591323 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

癌 / 免疫学 / 遺伝子 / トランスレーショナルリサーチ / ウイルス / 遺伝子治療 / ウイルスベクター / トランスレーショナル・リサーチ

【研究成果の概要】

治療用サイトカインを導入した樹状細胞(DC)投与は癌免疫療法における有望な選択の1つと考えられているが、その臨床応用には安全性に対する検討が必要である。特に生体内に投与されたDCがどのような挙動を示すかは十分に解析されていない。そこで、前臨床試験として治療遺伝子導入DCの特性評価ならびにマウスを用いた投与DCの体内動態を追跡するシステムを立ち上げた。
治療遺伝子には抗腫瘍免疫反応を誘導するマウスInterleukin-12(mIL-12)を選択し、組換えアデノウイルスベクター; Ad-mIL-12を調製した。一方、導入細胞となるマウス未成熟樹状細胞(m-iDC)は大腿骨から採取した骨髄細胞をGM-CSF存在下にて誘導した。このm-iDCを含む調製細胞にAd-mIL-12を遠心操作によって感染させ、得られた遺伝子導入樹状細胞(mIL-12-iDC)の表面抗原解析ならびに細胞培養上清中のmIL-12タンパク量の測定を行った。その結果、CD80,CD86の発現維持が認められ、さらに培養上清中にmIL-12を確認できたことから、このmIL-12-iDCが免疫賦活細胞として適応可能であることが示された。
次に、このmIL-12-iDCを正常マウス肝臓に局所投与し、同一個体から血清生化学的検査値、脾臓重量、骨髄有核細胞数、血清中mIL-12濃度を比較したところ、無処置群及び開腹処置群との有意差は認められなかった。さらに投与DCの体内動態評価にアデノウイルスDNAのE4領域を標的としたリアルタイムPCR法を確立し検討したところ、一部のマウスの肺・脾臓サンプルからウイルスDNAが検出され、肝臓に投与したmIL-12-iDCが血流を介して他臓器に到達していた可能性が示唆された。本システムは治療遺伝子を導入した細胞を用いる遺伝子治療において、その安全性を検討する場合に有効な手段になりうると考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】2,800千円 (直接経費: 2,800千円)

【研究分野】動物生理・行動

【研究領域課題番号】16370035 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ミツバチ / 社会性 / 攻撃性 / ダンス言語 / 行動 / 脳 / 遺伝子 / 分子的基盤 / 初期応答遺伝子 / 転写因子 / 線虫 / 攻撃行動 / ウイルス

【研究成果の概要】

本研究では、ミツバチが示す様々な社会性行動(特に、ダンスコミュニケーションと攻撃性)の分子的基盤を探るため、脳で領野や行動選択的に発現する遺伝子の同定と解析を進めた。主な研究成果は以下の通りである。
(1)新規な最初期遺伝子Kakuseiの発現を指標に、ダンスコミュニケーションに関わる脳領野を調べた結果、キノコ体(昆虫脳の高次中枢)の小型ケニヨン細胞の活動が採餌蜂とダンス蜂で亢進していることを見出した。
(2)女王蜂に比べて働き蜂(育児蜂/採餌蜂)に強く発現する遺伝子を検索した結果、エクダイソン情報伝達に関わるホルモン受容体HR38遺伝子が採餌蜂の脳のキノコ体の小型ケニヨン細胞選択的に発現することを示した。
(3)エクダイソン情報伝達に関わる2種類の遺伝子、BR-C、E75について、いずれも脳でキノコ体選択的に発現するが、キノコ体の中では発現する神経細胞が異なることを見出し、キノコ体の神経細胞の役割分担を示唆した。
(4)キノコ体選択的に発現する転写因子Mblk-1の線虫ホモログ(MBR-1)について遺伝学的な機能解析を行い、発生段階で生じる余分な神経突起の剪断において、UNC86-MBR-1の転写カスケードが関わることを示した。
(5)ミツバチの視覚記憶のメカニズムを調べるために、固定した働き蜂を用いて視覚刺激と口吻伸展反射の連合学習系を開発した。この実験系を用いて、ミツバチでも視覚順応や残像が起きていることを示した。
(6)攻撃蜂の脳から同定されたKakugoウイルスについて疫学調査を行い、感染率が高いコロニーでは攻撃蜂のみならず巣内の働き蜂からもウイルスが検出されることを見出した。また、ダニが感染を媒介する可能性を示した。
これらの知見はいずれも独創性が高く、ミツバチの社会性行動の分子的基盤の解析の端緒となるものと期待される。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】15,700千円 (直接経費: 15,700千円)

【研究分野】脳神経外科学

【研究領域課題番号】16390418 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子 / ウイルス / 脳神経疾患 / バイオテクノロジー / 遺伝子治療 / ウイルスベクター / アデノ随判ウイルス / 脳腫瘍 / 脳血管障害 / 動脈硬化症 / IL-10

【研究成果の概要】

非病原性のアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するベクターは、頭蓋内での炎症反応も起こしにくく、神経組織や筋肉などにおいて、単回の投与で長期間安定した発現が可能である。本研究では、脳神経疾患への臨床応用をめざした次の研究段階として各種血清型AAVを用い、併用薬剤を用いた遺伝子発現増強効果、発現制御システム、およびベクターの筋注による蛋白質補充療法の効果を検討した。
1. ApoE欠損マウスにAAVベクターを用いてIL-10を体内発現させ、炎症制御による粥状硬化病変の進展予防効果と、IL-10による血清コレステロール値低下作用を証明した。
2.ウイルス宿主細胞の培養において、通常の研究室で実施可能なガス交換システムを用いた大規模培養系を開発し、従来の作業効率を大きく改善した。
3.ハンチンチン病モデルマウス線条体にAAVベクターを用いて標的分子に対するshRNAを導入し、発症した後でも凝集体を減少させ症状の悪化進行を遅延できる可能性を示唆した。
4. AAVベクターのゲノムは標的細胞への感染後ただちに核内でピストン修飾され、ピストン脱アセチル化酵素阻害剤により、自殺遺伝子の発現と効果が増強されることを証明した。
5. AAVベクター粗製物の精製において、新規強イオン交換膜を利用した中空粒子の回収および除去方法を開発した。
6.間葉系幹細胞の腫瘍集積性を利用し、ベクター産生細胞に改変した腫瘍標的化細胞を構築した。これを用い、担癌動物モデルにおける腫瘍組織内での導入遺伝子増幅効果を確認した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】12,700千円 (直接経費: 12,700千円)

【研究分野】動物生理・行動

【研究領域課題番号】15657019 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ミツバチ / 攻撃行動 / 利他的行動 / 脳 / ウイルス / 社会性昆虫 / 感染 / 遺伝子

【研究成果の概要】

ミツバチは社会性昆虫であり、女王蜂(生殖カースト)が専ら産卵し、働き蜂(労働カースト)は育児や門番、採餌などの労働に携わる。ミツバチの働き蜂の天敵への攻撃行動は、自身が死亡する可能性が高い点で利他行動の代表例である。本研究では、働き蜂の攻撃行動を規定する分子的基盤を解析する目的で、攻撃的な働き蜂の脳で選択的に発現する遺伝子を検索した結果、攻撃蜂の脳に選択的に感染している新規なRNAウイルスを同定した。
最初に、囮であるオオスズメバチに攻撃を仕掛けた働き蜂(攻撃蜂)と、スズメバチから逃避した働き蜂(逃避蜂)を採集し、それぞれの脳からRNAを抽出した。Differential display法により、攻撃蜂の脳に選択的に存在するRNAを検索した結果、kakugoと命名したRNAを同定した。cDNAクローニングの結果、kakugo RNAは様々なピコルナ様ウイルスのポリプロテインと有意な相同性を示すタンパク質をコードすることが判明した。このことは、kakugo RNAが新規なウイルスのゲノムRNAであり、攻撃蜂の脳はこのウイルスに感染していることを示唆している。また、攻撃蜂の細胞粗抽出液をショ糖密度勾配遠心により分離したところ、kakugo RNAは遊離のmRNAの他、ウイルス粒子に相当する分画にも検出された。さらに、攻撃蜂の細胞粗抽出液を非感染の働き蜂に注射したところ、3日後の脳でkakugo RNAが増幅していることが判明した。このことは、kakugo RNAが確かに感染性のあるウイルス粒子を形成することを示唆している。さらに、kakugoウイルスは攻撃蜂の脳では検出される一方で、育児蜂や採餌蜂では検出されず、攻撃行動とkakugoウイルスの感染が密接に関連することが示された。本研究は、動物の本能的な攻撃行動とウイルス感染が関連することを最初に示唆した点で学術的に価値が高い。

【研究種目】萌芽研究

【研究期間】2003

【配分額】3,400千円 (直接経費: 3,400千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】13671746 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

転写因子 / ウイルス / ファージ / ペプチド / 遺伝子 / 転写活性 / 抗ウイルス剤 / 子宮頸癌

【研究成果の概要】

我々はこれまで子宮頸癌についてHPV感染を指標にした分子診断の可能性について検討してきた。まず、HPV16型のE7蛋白質に対する抗体が、HPV16型のDNAが検出される進行子宮頸癌患者の血清中から検出が可能な症例があることを明らかにした(Fujii et al.:Jpn J Cancer Res 86:28-34,1995)。さらに子宮頸癌の前癌病変を認めた患者より子宮頚部擦過細胞を採取し、RT-PCR法にてE6・E7の転写産物が病変の進行に伴い検出率が上昇することを明らかにした(Fujii et al : Gynecol Oncol 58:210-215,1995)。これらの結果はE6・E7遺伝子産物が臨床的にも癌の発生や維持に深く関与していることを示している。E2蛋白質はE6・E7遺伝子の発現を調節しているDNA結合蛋白質であることから、ウイルス発癌の機構を解析する上で極めて重要な蛋白質といえる。そこで、E2蛋白質に結合し、その転写機能を阻害するペプチドを単離することを目的とした。HPV16型のE2蛋白質を大腸菌で発現させ蛋白質を精製した。このE2蛋白質をプレートに固相化し、任意のアミノ酸配列がファージのファイバー蛋白質に発現しているライブラリーを用いて、E2蛋白質に結合するファージクローンを単離した。その結果、トリプトファンを含むペプチド配列が単離された。そこで、このトリプトファンをアラニンに置換したのち、E2蛋白質との結合性を比較したところ、変異ペプチドでは、その結合能が低下した。さらに、単離されたペプチド配列に核移行シグナルを付加した合成ペプチドを作成し、E2遺伝子の転写活性に及ぼす影響についてルシフェラーゼアッセイ法にて検討したところ、転写活性の低下が認められた。以上のことから、単離されたペプチドはE2蛋白質に結合し、その転写活性を抑制することが判明した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)