【研究分野】ゲノム医科学

【研究領域課題番号】16K07211 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

エクソーム解析 / 疾患遺伝子変異 / 遺伝性疾患 / 次世代シーケンサー / CNV解析 / ミトコンドリア / 全ゲノムシーケンス / 疾患原因変異同定手法開発 / 次世代シーケンスのバイオインフォマティクス / 生体生命情報学 / 脳神経疾患 / バイオテクノロジー / 遺伝子 / 遺伝学

【研究成果の概要】

次世代シーケンサーを用いたエクソーム解析は疾患原因変異同定に有用な手法であるが、その同定率はこれまで30%程度で未同定例が多いという課題があった。
そこで我々は、原因変異同定率を更に向上させるための複数手法を統合させた解析手法を開発した。通常法に加え、独自開発した挿入・欠失（indel）検出ソフトの開発、コピー数変異の検出における最良法の検証と組み込み、ミトコンドリアDNAの解析手法の追加、タンパク質ドメイン解析による候補変異の絞り込み手法、等を組み込むことで新たな疾患変異を同定する手法を確立した。実際に多数の新規疾患原因変異を同定し、研究期間内に20報を超えるエクソーム関連論文を発表した。

【研究の社会的意義】

我々の研究成果で疾患の遺伝子変異を同定する新たな手法論を構築し発表することで、その同定率を10%以上増やすことができた。解析手法を改良することによって、未同定疾患原因変異の新たな発見も可能であることを証明したことで、将来的な解析への応用は当然であるが、過去データの再検証で新規原因変異が同定されることも期待される。病気の原因変異が分かると、病気のメカニズム解明や薬剤ターゲット候補の発見、将来の発症予測、等に役立たせることができ、本成果は今後その一助になると考えられる。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】統合動物科学

【研究領域課題番号】16K15062 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ES細胞 / 遺伝子 / 1細胞 / 幹細胞 / 蛍光 / バイオテクノロジー / 蛍光蛋白 / １細胞解析 / 蛍光タンパク / 1細胞解析

【研究成果の概要】

次世代シーケンサを用いた１細胞トランスクリプトーム解析が急速に進展している。しかし、シーケンサによる解析では、個々の細胞ごとの遺伝子発現の時系列情報が欠落する。この問題点を相補する方法として、本研究では、マイクロ流体デバイスを用いて、マウスES細胞の遺伝子発現を顕微鏡下で長期観察する方法を開発した。その結果、対象遺伝子の発現を、蛍光蛋白を用いて1週間に渡って計測することに成功した。今後、他の細胞への応用が期待される。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】16K14495 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アミド化合物 / アミド結合形成反応 / ペプチド / アデニル化酵素 / 求核置換反応 / ポリリン酸キナーゼ / D-アミノ酸 / バイオプロセス / 芳香族カルボン酸アミド / 酵素 / バイオテクノロジー / 遺伝子 / 生体分子 / 脂肪酸アミド / 生理活性

【研究成果の概要】

アミド化合物には生体分子や化成品など有用物質が多く、バイオプロセスによる効率的な合成法の開発が望まれている。研究代表者はカルボキシ基の酵素的アデニル化とアミンの求核置換反応によるアミド化合物合成法を開発している。本研究では本手法を拡張して合成可能なアミド化合物の多様化を検討した。Fatty acyl-AMP ligaseによる脂肪酸アミド合成法、非リボソーム型ペプチド合成酵素のアデニル化ドメインによる芳香族カルボン酸アミド及びD-アミノ酸含有ジペプチドの合成法を開発した。また、ポリリン酸キナーゼを利用した単一酵素によるAMPからのATP再生系を構築し、アミド合成プロセスの低コスト化を達成した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】ゲノム生物学

【研究領域課題番号】15H04319 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

CRISPR / dCas9 / base-pairing / thermodynamics / melting temperature / バイオテクノロジー / 遺伝子 / 核酸 / ゲノム / RNA

【研究成果の概要】

本研究は、CRISPR法の改良による次世代型ヒト遺伝子機能解明のための基盤技術の開発を目的とした研究である。CRISPRシステムとは、原核生物の免疫防御システムを利用した新しいゲノム編集法であり、あらゆる生物種に応用可能な画期的技術として注目されている。CRISPR法では、標的部位を塩基配列で識別するガイドRNAがCas9たんぱく質と複合体を形成し、ガイドRNAが対合したゲノム領域をCas9が切断する。そのため、本研究ではゲノム切断活性を伴わないdCas9を用い、実験的手法とバイオインフォマティックスを用いた手法を組み合わせることで、ゲノム編集効率が高く実用的な手法を確立することに成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】19,110千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 4,410千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】26289318 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオテクノロジー / 遺伝子 / 酵素 / 生体分子 / 生物・生体工学 / ペプチド / アミド化合物 / 酵素工学

【研究成果の概要】

多様な機能を有するアミド化合物の中でも、抗体に代わる中分子医薬品として注目されているペプチドには、血圧降下作用をはじめ抗酸化や抗疲労さらには呈味性を有するものなど多く、効率的なペプチド合成法の開発が望まれている。研究代表者は、無保護のアミノ酸から任意のジペプチドを合成可能な新規酵素を多数取得しており、それらを利用して塩味増強効果を有するジペプチドの探索や酵素の機能改変による効率的な合成プロセスを開発した。一方、汎用性のあるアミド化合物の新規合成法も開発しており、合成可能なアミド化合物の多様性を拡張した。併せてAMPやADPからのATPの再生系を構築し、プロセスの低コスト化を達成した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】16,250千円 (直接経費: 12,500千円、間接経費: 3,750千円)

【研究分野】応用微生物学

【研究領域課題番号】24248017 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオテクノロジー / 応用微生物 / 酵素 / 発現制御 / 遺伝子

【研究成果の概要】

本研究は、AAAを経由するリジン生合成酵素群、およびそれらと進化的起源を共有するアルギニンやロイシン生合成、TCA回路を構成する各酵素群の基質特異性の違いに焦点を当て、構造生物学、タンパク質工学、分子進化工学などを通じて、酵素の基質特異性創出原理を分子レベル・原子レベルで明らかにするとともに、好熱菌でのアミノ酸生産系の確立といった研究の応用還元も視野に入れて研究を行うものである。その目的のために、若干の消耗品の購入、および我々の研究成果を発表すると共に酵素の応用に関する最先端の情報を得るための国際シンポジウムへの派遣を行ったが、基盤研究(S)が採択されたため、本研究を廃止することとなった。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2012

【配分額】23,010千円 (直接経費: 17,700千円、間接経費: 5,310千円)

【研究分野】応用薬理学

【研究領域課題番号】24659265 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子修正 / 遺伝性神経筋疾患 / 細胞治療 / ゲノム / 細胞 / バイオテクノロジー / DMD / 遺伝子

【研究成果の概要】

Duchenne 型筋ジストロフィー(DMD)をはじめとする単一遺伝子病に対し、遺伝子治療によるタンパク質補充療法の非臨床試験が活発に推進され効果が期待されているが、将来的には遺伝子変異そのものの修正が根本的な治療として期待される。遺伝子組み換え技術を用いた遺伝子修正療法の実用化をめざし、より高い有効性と安全性、正確性を備えたシステムの構築を検討した。また、疾患モデルにおける炎症病態を解析し、遺伝子修正細胞のプラットフォームとして間葉系幹細胞や歯髄幹細胞の応用可能性を検証した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】耳鼻咽喉科学

【研究領域課題番号】24390391 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子 / 医療・福祉 / ゲノム / 脳神経疾患 / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

Auditory Neuropathy (AN)は著しく言語聴取力が低い新しい難聴の病態である。本研究ではANの新たな遺伝的原因の解明を目的とした。まず36例のAN症例でサンガー法による検討をして、25例でOTOF遺伝子に11種類の新規変異を同定し、1例でGJB2遺伝子に既知変異を同定した。OTOF遺伝子変異が1アレルの4例では全ゲノムSNP解析と定量的PCR解析で大欠失を同定しなかった。上記解析で変異を同定しなかった10例では、エクソーム解析で新規AN候補遺伝子を3種類(PNPLA3、RYR3、TACC2)同定し、1家系ではOPA1に新生突然変異の可能性が高い新規変異を同定した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2015-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】応用分子細胞生物学

【研究領域課題番号】22658111 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロテオーム / 蛋白質 / 遺伝子 / バイオテクノロジー / 発現制御

【研究成果の概要】

プロテインマイクロアレイは、1枚のスライド上に数千種類のタンパク質を固定したもので、大規模なタンパク質相互作用の検出などに利用されている。我々は、鋳型DNAと抗体をスライド上に固定し、スライド上でタンパク質を合成・捕捉するオンチップ転写翻訳マイクロアレイを開発した。さらに我々は、1つのスポット内で2種類のタンパク質を同時に発現させ、相互作用解析を行うオンチップ共発現マイクロアレイを開発した。この手法では解析するタンパク質をマトリックス状に組み合わせることで、1枚のスライド上で多対多の相互作用解析が可能となる。この系を用いて、転写因子Junとその結合候補因子群をモデルとして、タンパク質間およびタンパク質・DNA相互作用の検出に成功した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】3,590千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 390千円)

【研究分野】小児科学

【研究領域課題番号】17591093 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

移植・再生医療 / バイオテクノロジー / 臨床 / 遺伝子 / 再生医学

【研究成果の概要】

単一遺伝子異常に起因して骨髄細胞のいずれかの系列の細胞増殖が低下しており、正常な遺伝子の導入により細胞の分化増殖が正常化すると予想される疾患を対象として、遺伝子治療へ向けた遺伝子導入システムと導入された骨髄細胞の機能評価システムを確立することを目的とし研究を進めた。先天性好中球減少症を対象疾患とし、glucose 6-translocase(G6PT)遺伝子異常に起因する、糖原病1b型に合併する好中球低下症、好中球機能不全の改善を目的とした研究を行った。
まず、G6PT遺伝子発現Lentivirus vector(pCS-CDF-ChG6PT-PRE)を作成しウイルスタイターを測定した。次に健常臍帯血由来のCD34陽性細胞を分離し、Lentivirus vectorによるG6PT遺伝子ならびにGFP遺伝子の細胞導入を行った。導入後にMethylcellulose培地コロニー形成能を観察した結果、遺伝子導入効率は約10%ほどであった。最後にインフォームドコンセントを得た糖原病Ib型の患者より骨髄細胞を採取後、CD34陽性細胞を精製しGFP遺伝子あるいはG6PT遺伝子を導入した。そしてMethylcellulose colony assayにて培地上のコロニーの形成状態を観察し、G-CFU,GM-CSF,M-CSF,E-BFUの数を調べ、血球の各lineage形成能を調べた。また、メチルセルロース培地にて培養後に形成されたG-CFU,GM-CSF,M-CSF,E-BFUのそれぞれのコロニーより細胞を回収後、コロニーPCRにて遺伝子の導入効率を算定した。結果として遺伝子導入効率が低く(約10%程度)、導入条件や培養条件等を検討したが研究期間中には条件の最適化が完了できなかったため、引き続き研究を継続中である。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】3,730千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 330千円)

【研究分野】脳神経外科学

【研究領域課題番号】16390418 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子 / ウイルス / 脳神経疾患 / バイオテクノロジー / 遺伝子治療 / ウイルスベクター / アデノ随判ウイルス / 脳腫瘍 / 脳血管障害 / 動脈硬化症 / IL-10

【研究成果の概要】

非病原性のアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するベクターは、頭蓋内での炎症反応も起こしにくく、神経組織や筋肉などにおいて、単回の投与で長期間安定した発現が可能である。本研究では、脳神経疾患への臨床応用をめざした次の研究段階として各種血清型AAVを用い、併用薬剤を用いた遺伝子発現増強効果、発現制御システム、およびベクターの筋注による蛋白質補充療法の効果を検討した。
1. ApoE欠損マウスにAAVベクターを用いてIL-10を体内発現させ、炎症制御による粥状硬化病変の進展予防効果と、IL-10による血清コレステロール値低下作用を証明した。
2.ウイルス宿主細胞の培養において、通常の研究室で実施可能なガス交換システムを用いた大規模培養系を開発し、従来の作業効率を大きく改善した。
3.ハンチンチン病モデルマウス線条体にAAVベクターを用いて標的分子に対するshRNAを導入し、発症した後でも凝集体を減少させ症状の悪化進行を遅延できる可能性を示唆した。
4. AAVベクターのゲノムは標的細胞への感染後ただちに核内でピストン修飾され、ピストン脱アセチル化酵素阻害剤により、自殺遺伝子の発現と効果が増強されることを証明した。
5. AAVベクター粗製物の精製において、新規強イオン交換膜を利用した中空粒子の回収および除去方法を開発した。
6.間葉系幹細胞の腫瘍集積性を利用し、ベクター産生細胞に改変した腫瘍標的化細胞を構築した。これを用い、担癌動物モデルにおける腫瘍組織内での導入遺伝子増幅効果を確認した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】12,700千円 (直接経費: 12,700千円)