【研究領域課題番号】21H02422 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

高浸透圧 / MAPキナーゼ経路 / リン酸化 / 酵母 / 出芽酵母 / シグナル伝達 / MAPキナーゼ / キナーゼ / センサー

【研究成果の概要】

本研究では、酵母の高浸透圧応答性Hog1 MAPK経路で見出した高浸透圧による細胞質局在キナーゼのリン酸化増強作用の仕組みの解析を行なった。リン酸化増強の作用点として（1）Pbs2 MAP2K-Hog1 MAPK反応過程、（2） Ssk2 MAP3K-Pbs2 MAP2K反応過程の２つが存在する。特に（2）のリン酸化増強については仕組みが全く不明であるため、（2）に焦点を当てて解析した。まず、高浸透圧応答に必須な上流のSln1センサーの破壊株などを使った分子遺伝学的、生化学的解析から、このリン酸化反応過程が実際に高浸透圧増強を受けることを示した。またこの反応増強にSsk2と結合するレスポンスレギュレーターSsk1の特定の領域が必要なこともわかった。（2）の反応増強はPbs2のリン酸化を指標にしているため、現時点では高浸透圧により、Ssk2の活性が増強しているのか、Pbs2がリン酸化を受けやすくなっているのかがわからない。そこで、Ssk2の制御領域への系統的欠失変異の導入、Pbs2のランダム変異導入によって、高浸透圧によるリン酸化増強を模倣した変異体の単離を試みた。その結果、Ssk2、Pbs2両者で高浸透圧なしでも恒常的にHog1経路を活性化する変異体の取得に成功した。
高浸透圧によるPbs2リン酸化増強の理由として、リン酸化が高浸透圧で増強される可能性に加え、Pbs2の脱リン酸化が高浸透圧によって抑制される可能性も考えられる（Pbs2のリン酸化レベルはどちらの場合も上がる）。そこでPbs2の脱リン酸化に関わるホスファターゼを探索し、Ptc1を責任ホスファターゼの一つとして同定した。
以上より、（2）のリン酸化増強の仕組みの解明に向けて、本年度の研究で複数の手がかりを得ることができたと考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】22791547 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮内膜 / シグナル伝達 / 脱落膜化 / 着床 / キナーゼ / 上皮間葉転換

【研究成果の概要】

本研究では,子宮内膜の増殖・分化に伴って活性化されるチロシンキナーゼSRCが関与する細胞内シグナル伝達経路を,主にプロテオミクスの手法を用いて分子レベルで解明し,着床ならびに妊娠成立・維持における役割を明らかにすることを目的とする.その研究のための主要なマテリアルとして,活性化型SRCのアデノウイルスベクターの作成を試みたが,最終的には作成には至っていない.しかし,内膜分化の指標となるレポーターのコンストラクト,不死化ヒト内膜細胞株, in vivo内膜再構成システムなど,諸実験に必要なその他の研究マテリアル・研究ツールの準備・作成・確立は行い得た.一方,内膜腺上皮の機能発現においては, N-カドヘリンの関与するepithelial mesenchymal transition(EMT)が重要な役割を担う可能性を示した.

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】医療系薬学

【研究領域課題番号】21390041 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

癌 / 薬剤反応性 / キナーゼ / 分子標的薬 / オフ・ターゲット / 薬理学 / 薬物動態 / シグナル伝達 / 発現制御 / 生体分子 / 骨粗鬆症 / 骨芽細胞 / 破骨細胞 / 双方向シグナル / RANKL / 薬物体内動態 / 毒性

【研究成果の概要】

チロシンキナーゼ阻害薬(TKI)であるerlotinibおよびsunitinib投与時に出現する種々の副作用は、off-targetキナーゼ、STK10およびPHKG1/2に対する阻害を考慮することで説明可能であることが明らかとなった。TKIによる副作用発現予測には、臨床血中濃度におけるoff-targetキナーゼの阻害率を考慮することが極めて重要であると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2009 - 2011

【配分額】18,460千円 (直接経費: 14,200千円、間接経費: 4,260千円)

【研究分野】生体関連化学

【研究領域課題番号】20685012 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プローブ / 可視化 / キナーゼ / ユビキチン / タンパク質分解 / タンパク質リン酸化 / 生物発光 / in vivo / イメージング / シグナル伝達

【研究成果の概要】

分子イメージングにおいては,特定の生体イオンや生体分子を捕まえて光を発生する,いわゆるプローブと呼ばれる新しい分子の開発が必要となる.本研究では,様々な生命機能や疾患において極めて重要な分子過程であるタンパク質のリン酸化について,その生体内(in vivo)での動態を可視化計測する新しい原理のプローブ("分解制御型プローブ"と名付ける)の開発研究を行った.

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】25,610千円 (直接経費: 19,700千円、間接経費: 5,910千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】18380069 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シグナル伝達 / 植物 / 生殖 / リン酸化 / キナーゼ / 自家不和合性 / アブラナ科 / シロイヌナズナ

【研究成果の概要】

本研究は、アブラナ科植物の自家和合性変異株の原因遺伝子として同定された膜アンカー型細胞質キナーゼMLPKの自家不和合性情報伝達における機能解明を目的として行われた。
1.MLPKの機能の解明
MLPKが転写開始部位を異にする2種類の転写産物を介してN末端配列の異なる2種類の蛋白質に翻訳されること、両者共に乳頭細胞で発現し異なる機構で細胞膜上に局在すること、雌ずい因子のSRK受容体型キナーゼと直接相互作用し自家不和合性の情報を伝達する能力を有することを明らかにした。MLPKがSPKと共に花粉因子SP11に対する受容体複合体を構成している可能性を提唱した。
2.MLPKの標的分子の特定
酵母two hybrid系を用いてMLPKと相互作用する柱頭発現タンパク質を複数同定した。さらに、発現タンパク質を用いたin vitro結合実験およびin vitroリン酸化実験等により標的分子の絞り込みを行った。活性型MLPKとのみ特異的に結合し、高選択的にリン酸化される分子も存在し、有力なMLPK標的分子としてさらなる解析を継続中である。また、シロイヌナズナにおけるMLPKのオーソログ遺伝子と推定されるAPK1b遺伝子についてタグライン解析を行ったが、野生型と比較して異なる表現型は認められなかった。APKlbが自家不和合性の情報伝達系においてのみ機能している可能性と、他の機能も有するが遺伝子の冗長性により表現型が現れない可能性が示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】16,860千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 2,160千円)

【研究分野】神経化学・神経薬理学

【研究領域課題番号】17300116 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脳・神経 / 酵素 / 遺伝子 / シグナル伝達 / 生体分子 / カルシウム / キナーゼ / 低分子量GTP結合蛋白質 / アクチン

【研究成果の概要】

本研究では、Rho活性やカルシウム流入のより生じる神経アクチン細胞骨格などの再編成機構と、その下流の生理作用などについて探索した。
まず樹状突起形成・伸展を制御するCaMK分子種を調べた。大脳皮質培養細胞の樹状突起形成は、CaMKIα、CaMKIIやCaMKIVのRNAiでは全く阻害されず、CLICK-III/CaMKIγのRNAiのみ顕著な短縮とRac活性の低下が明らかとなった。さらなる実験から、CLICK-III/CaMKIγ一STEF-Rac経路の重要性が示された(Takemoto-Kimura et al.改訂中)。
続いて、CaMK類似キナーゼであるCLICK-I/DCAMKL1およびCLICK-II/DCaMKL2の樹状突起形態に対する影響を調べたところ、doublecortin領域を有するアイソフォームでは、過剰発現により微小管bundlingを起こすが、アクチン骨格への大きな影響は見られなかった(Ohmae et al. J. Biol. Chem. 2006)。
上記の過程で、lipofection、adenovirus、遺伝子銃による遺伝子導入法の最適化を行い、スパインにおけるPSD-95変異体の機能異常(Nonaka et al.,J. Neurosci.,2006)や、アクチン線維・カルシウム流入による海馬・Purkinje細胞樹状突起における、cortactinやShankの局在変化を明らかにした(Iki et al.,Eur. J. Neurosci. 2005; Fuse et al.準備中)。
さらに、幼弱細胞の移動時にはRho-mDial依存的アクチン骨格再編成により、ApcやSrcの複合体の位置が制御されていることを解明した(Yamana et al. Mol. Cell Biol. 2006)。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】15,100千円 (直接経費: 15,100千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】07409001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

サイトカン / サイトカン受容体 / シグナル伝達 / 造血 / アポトーシス / 分化 / RAS / STAT / サイトカイン / サイトカイン受容体 / 血管内皮 / 発生 / 誘導遺伝子 / 細胞分化 / 造血因子 / JAK / Ras / 幹細胞 / 造血細胞 / 増殖 / 細胞死 / キナーゼ / 細胞増殖

【研究成果の概要】

IL-3/GM-CSF/IL-5受容体の変異体を使ったシグナルの解析からRASとSTAT5という二つの主要なシグナル伝達経路が明らかになってきたので、これらの活性化とサイトカイン機能との関連を中心に研究を展開した。造血細胞はその増殖だけでなく、生存にもサイトカインによる刺激を必要としており、RASの活性化は造血細胞においては細胞死の抑制に重要であることを明らかにした。さらに、RASはRAF/MAPキナーゼ経路とPI3キナーゼ経路の両方を使って細胞死を抑制していること、またサイトカイン除去による細胞死にもcaspaseが関与することなどを明かにした。一方、多くのサイトカインはSTAT5を活性化するが、その生理的意義を明らかにするために、STAT5誘導性遺伝子の分離を行い、SH2ドメインをもつ新規シグナル分子CIS,IL-6ファミリーのサイトカインOncostatin M(OSM)などを同定した。CISはサイトカインのシグナルをnegativeに制御する分子であることを示した。優勢抑制型のSTAT5変異体を用いた実験から、STAT5が造血細胞の細胞あるいは赤芽球分化に重要な機能をもつことを明らかにした。さらに、STAT5とRASによるシグナル経路がクロストークすることも示した。STAT5誘導遺伝子として同定されたOSMの機能の検索を行い、胎生期での血球発生過程や生殖細胞などに作用があることを示した。また、遺伝子クローニングによりOSM受容体の分子構造も明らかにした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1995 - 1998

【配分額】36,500千円 (直接経費: 36,500千円)