【研究領域課題番号】20H00315 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

進化分子工学 / 機械学習 / タンパク質 / 抗体

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2020-04-01 - 2024-03-31

【配分額】44,720千円 (直接経費: 34,400千円、間接経費: 10,320千円)

【研究分野】生体医工学・生体材料学

【研究領域課題番号】17H02103 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

抗体 / ペプチド / 核酸 / ドラッグデリバリーシステム / 細胞膜透過 / 蛋白質 / 癌 / バイオテクノロジー / 共焦点顕微鏡

【研究成果の概要】

標的分子に対して高い特異性と親和性をもつ抗体／ペプチド／核酸などのバイオ医薬は、従来の低分子化合物医薬と比べて副作用が少なく、治療効果が高い究極の分子標的薬として注目されているが、細胞膜透過性が低いという欠点があり、効率のよいドラッグデリバリーシステム（DDS）の開発が求められていた。本研究では、我々が発見した膜透過促進ペプチドを利用して、抗体／ペプチド／核酸を従来よりも効率よく細胞質に送達できることを示した。また、基礎研究として、その膜透過促進メカニズムの解明も並行して進めた。

【研究の社会的意義】

我々が発見した膜透過促進ペプチドはヒト天然タンパク質由来であり免疫原性の懸念が少ないという利点もあることから、この独自の膜透過促進ペプチドを連結した抗体／ペプチド／核酸がヒト細胞の細胞質に効率よく送達されるという本研究の成果は、将来的に、細胞内の疾患標的に作用する新しい抗体医薬の開発や、ペプチドや核酸からなる中分子医薬の効率的なデリバリーに応用することが期待できる。これにより、我が国のバイオ創薬技術の基盤強化、ひいては国民の医療・福祉の向上に大きく貢献することが期待できる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】17H03975 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオ医薬 / 抗体医薬 / 安定性 / 凝集 / タンパク質 / 界面 / 免疫原性 / 分析 / バイオ医薬品 / 蛋白質 / 凝集体 / 質量分析 / 立体構造 / 抗体 / 免疫複合体 / TNF / 超遠心分析 / 沈降速度法 / 生体分子 / 薬学 / シグナル伝達 / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

本研究によりバイオ医薬品で発生するタンパク質凝集体の定量的解析手法が確立し、凝集の原因となるストレスの特定に成功し、さらに凝集体の免疫原性との関連性について解明することができた。とくに、プレフィルドシリンジに塗布されたシリコンオイルとタンパク質が複合体となった際の免疫原性への影響は顕著であり、製剤における容器設計の重要性がより明確となった。また、従来から提唱されてきた、コロイド安定性と構造安定性に加えて、界面安定性の向上が凝集体発生の抑制には需要であることを示すことができた。さらに今回見出した振動や衝撃がタンパク質凝集を引き起こす点も医薬品の安定性を高める上で非常に有益であるといえる。

【研究の社会的意義】

本研究は、近年、利用されているバイオ医薬品の安定性と安全性に関するものであるが、これまで不明点が多かったタンパク質凝集体と副作用の関係を実験的に示唆することができた社会的意義の大きい研究成果である。特に、製薬企業から医療現場で利用される実際の場面へとフィードバックが可能な知見が数多く含まれており、かつ、応急処置的な対応では無く、包括的かつ根本的に医薬品の安定性を高めることが可能となることから、科学的意義は当然ながら、産業的意義が大きいといえる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】16,380千円 (直接経費: 12,600千円、間接経費: 3,780千円)

【研究分野】化学系薬学

【研究領域課題番号】17H01522 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

抗体ー薬物複合体 / トリプトファン / 抗がん剤 / ラジカル / 官能基許容性 / タンパク質修飾 / リン酸化 / ヒストン修飾 / 酸化 / 抗体 / ADC / 電解酸化 / 有機合成化学 / 薬学 / タンパク質 / 生物機能 / 合成化学 / 蛋白質 / 有機化学

【研究成果の概要】

独自に開発したトリプトファン選択的タンパク質修飾反応を用いた、均質性の高い抗体ー薬物複合体の合成と活性評価を目標とした。その結果、keto-ABNOと抗がん剤を結合させた分子を、薬物／抗体比を制御して、抗体に対して結合することに成功した。これらの活性を評価したところ、抗体に結合する抗原を発現したがん細胞に対して毒性を発現することを見いだした。以上の成果から、トリプトファン結合型抗体ー薬物複合体は均質性高く合成することが可能で、新規な抗がん剤として高い潜在性を有していることを示すことができた。

【研究の社会的意義】

副作用が低く、効果が高い抗がん剤の開発が広く望まれている。強い細胞毒性を持つ分子を抗体に結合させて、毒をがん細胞選択的に送り込む抗体ー薬物複合体は、そのような抗がん剤であると注目されている。従来の合成法では、抗体の様々な位置に不均質の結合数で薬物が結合した抗体ー薬物複合体しか作れなかった。一方で、我々が開発した方法を用いると、特定の位置に数を定めて抗体ー薬物複合体を合成できるようになった。この新しい抗体ー薬物複合体は、抗がん効果を示すことを明らかとした。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】41,990千円 (直接経費: 32,300千円、間接経費: 9,690千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】16H02420 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質-蛋白質相互作用 / 抗体 / 低分子 / 阻害剤 / 熱力学 / 速度論 / 蛋白質 / 物理化学 / 創薬 / 薬学 / 遷移状態 / 蛋白質間相互作用

【研究成果の概要】

本研究では、癌疾患に関連するPPI、細菌感染に関連するPPIなど、創薬へとつながる有力なモデルPPIを選択し、熱力学、速度論、そして計算科学を駆使して、これらPPIの精密な相互作用解析と、抗体や低分子化合物によるPPIに対する阻害機構解明を行った。１つの標的蛋白質に対して、PPIのプロセスに関連する中間体構造を制御する制御剤を得ることに成功した。さらに、これら抗体と低分子それぞれに関する阻害メカニズムの分子レベルでの解析により、抗体からの低分子化によるPPI制御剤の設計に関する知見を得ることができた。本研究よりPPIに対する制御分子設計における新しい戦略指針が得られたと考えられる。

【研究の社会的意義】

PPIの特異的な制御は、従来、抗体によるものが主な戦術で、低分子展開は限定されていた。本研究では明確な結合ポケットが構造上では分からないPPIに対して、いくつかの低分子阻害剤を得ることに成功した。その特徴として、１）SPR, ITC, DSFなどの物理化学的解析より、標的への特異的な結合が観察され、２）細胞アッセイレベルで活性が得られた。このように、PPIを制御するための物理化学的アプローチにより制御剤探索が可能であることは、蛋白質との特異的な相互作用による制御剤創出が可能であることを示唆し、創薬モダリティの観点において大きな学術的・社会的意義がある。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】45,500千円 (直接経費: 35,000千円、間接経費: 10,500千円)

【研究分野】ナノバイオサイエンス

【研究領域課題番号】15H02006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

binding protein / screening / translation / single-molecule / 人工抗体 / 1分子定量 / タンパク質 / １分子定量 / 一分子定量 / 抗体 / １分子 / 血管内皮細胞増殖因子受容体

【研究成果の概要】

高速人工抗体創製法を開発し、得られた抗体をタンパク質の1分子単位定量に応用することを目的とした。まず抗体の創製を飛躍的に高速化するために、我々が開発した特殊ペプチド創製法を人工抗体創製用に改良し、迅速に人工抗体を創製する方法を開発した。実際にEGFR1やHER2の細胞外ドメインをモデルタンパク質としてセレクションを行い、nMレベルの解離定数で結合する抗体を取得した。さらに、細胞少数タンパク質に対しても抗体を作製した。得られた人工抗体を蛍光標識して、ガラス基板に固定したタンパク質標的を１分子単位で検出することに成功した。これらの技術はタンパク質の1分子単位定量の基盤技術になると期待される。

【研究の社会的意義】

１細胞におけるタンパク質の分子数は、タンパク質の種類によって大きく異なる。これら様々な数からなるタンパク質群の定量は、生物科学において個々の細胞の個性を理解するための重要な課題である。そこで近年、タンパク質を1分子単位で定量する新手法の開発が進められている。このボトルネックは、標的に対して高い特異性と親和性を持った高性能抗体の作製である。本研究では、簡便に高速で人工抗体を作製する手法を開発した。さらに得られた人工抗体を用いてガラス基板上に固定化した標的を1分子単位で検出することができることを示した。本方法は、タンパク質の１分子定量を可能にする重要な基盤技術となると期待される。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2015-04-01 - 2019-03-31

【配分額】41,990千円 (直接経費: 32,300千円、間接経費: 9,690千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】15H04191 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオセンサー / バイオテクノロジー / 抗体 / 抗原 / 蛍光 / クエンチ / ケミカルバイオロジー / 部位特異的修飾 / 結合タンパク質 / 蛋白質 / 免疫学 / プロテオーム / マイクロアレイ / タンパク質

【研究成果の概要】

従来の免疫測定法には，測定に多数のステップと最低数時間の時間を要する問題があった。我々は最近，組み換え抗体を用いた蛍光免疫センサータンパク質Quenchbody (Q-body)の構築原理を見いだし，サンプルと混合するだけで低分子からタンパク質まで多くの目的物質（抗原）を蛍光検出することに成功した。今回，その動作原理を精査することで，組換え抗体のみならず天然抗体をもQ-body化しうる方法論を複数確立した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究分野】産婦人科学

【研究領域課題番号】23659783 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

子宮 / 幹細胞 / 抗体 / 蛋白

【研究成果の概要】

ヒト子宮内膜の幹細胞特性をin vivo で検証するアッセイ系を開発した.これにより,改良型シグナルシークエンストラップ法(SST-REX法)による解析で同定・選別される細胞集団が,真に幹細胞としての特性を有しているかどうかの検証が可能となり,SST-REX法による幹細胞同定システムの基盤となる技術と知見が得られた.

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】22651079 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アミロイド線維 / アルギニン / アルツハイマー病 / 低分子化合物 / ファージディスプレイ / ペプチドライブラリー / クマリン / globulomer / SciFinder / 蛋白質 / インフォマティクス / アミロイドβ / 抗体 / ペプチド / プロドラッグ

【研究成果の概要】

タンパク質の機能改変を行うタンパク質工学においては、従来、生化学的研究とインフォマティクス的研究が独立に行われている場合が多く、タンパク質のメカニズム解明の新たなブレークスルーのためには、実験とインフォマティクスを相乗的に結びつけ新たな発見に導く融合的研究が必要である。本研究では、実験手法としてのファージディスプレイ法と、情報学的手法としての最適化を組み合わせることにより、アミロイドタンパクの凝集を阻害する新規ペプチドとそれを模倣する低分子化合物を見出すことに成功した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】3,550千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 450千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】21760634 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / 細胞内導入 / 酵素 / 細胞免疫療法 / 癌 / 抗体 / 膜透過性ペプチド / PEG脂質 / 癌細胞 / 樹状細胞 / 貪食 / リフォールディング / 転写因子 / ポリアルギニン / 脱エンドソーム / 細胞資源

【研究成果の概要】

酵素を用いて蛋白質のC末端特異的に合成分子を修飾し、効率よく細胞膜および細胞質に蛋白質を導入する技術を開発した。PEG脂質を細胞膜上で目的蛋白質に修飾する技術を開発し、この技術を使って癌細胞上に抗体を導入して樹状細胞による癌細胞の貪食効率を向上することに成功した。また、ラジカル発生色素を含む細胞膜透過ペプチドを目的蛋白質に修飾し、光照射によって目的蛋白質を細胞質内へ導入する技術も開発した。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2009 - 2010

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】06305006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / X線結晶解析 / 蛋蛋白質 / 糖蛋白質 / 抗体 / 結晶化 / 三次元構造 / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 蛋白質三次元構造 / 結晶構造 / 生体高分子 / X線回折法 / 分子生物学

【研究成果の概要】

蛋白質の機能の解明と応用の研究を進展させるため、蛋白質の三次元構造の研究の分担を通じ、X線結晶解析の方法の新展開と、蛋白質の機能構造の迅速な研究体制の構築を本研究の目的とした。
平成6〜7年度の計画として、1 アミノ酸改変蛋白質、2 各種プロテアーゼとその阻害剤との複合体、3 アミラーゼ等とその阻害蛋白質、4 核酸および核酸を認識する蛋白質、5 抗原を認識する抗体と抗原複合体 6 膜蛋白質、結晶化法、7 ウイルス等の巨大分子単位、その直接解析法、8 アミノ酸改変蛋白質の産製と迅速解析法、9 高速高精度なX線回折データ測定法、10 X線異常分散を利用する解析法、11 迅速な自動分子置換構造解析システムの構築、12 糖蛋白質の結晶化と解析の手法、13 溶液NMR情報を用いるX線解析法など、蛋白質構造の解析と、新解析手法の開発と構築に関する研究を行い、これらに関する成果を得た。
研究の成果として、系統化した結晶化法と結晶化用の試料調製法に基づいて、膜蛋白質bovine cytochrome coxidaseと糖蛋白質human renal dipeptidaseの解析に成功した。高精度データ測定の装置システムとソフトウェアCa等の異常分散効果の利用法、多波長異常分散法による直接解析法、自動分子置換解析法などを開発・構築したキメラ酵素の作成とその構造の解析、酵素の耐熱化の機構の研究、トリプシン族の酵素とその阻害剤との複合体の解析、解糖系等の酵素およびその阻害蛋白質の解析、抗体のFvとFabのフラグメントと抗原ハプテンとの複合体の解析などを行ない、成果を公表した。
方法論的展開と研究者間の連携と協力をはかる研究の骨子を達成するため、公開の研究会を2回開催し、研究の進捗と成果を取りまとめた研究中間報告書を6年度に、さらに、研究成果報告書を7年度に印刷し、配布した

【研究種目】総合研究(A)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】9,300千円 (直接経費: 9,300千円)

【研究分野】結晶学

【研究領域課題番号】02558011 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

微小結晶 / 蛋白質 / X線結晶構造解析 / イメージングプレート / シンクロトロン放射光 / 異常分散法 / 免疫グロブリン / 抗体 / X線結晶構造解析法 / 蛋白質結晶学 / 回折強度測定法 / イメ-ジングプレ-ト / 多波長異常分散法

【研究成果の概要】

微小蛋白質結晶のX線構造解析法の開発を目的とし、輝尽性蛍光体イメージングプレートを採用した高感度で高精度のX線カメラ露光リアルタイム検出装置を試作し、X線異常分散効果を利用して構造解析の処理を行うための計算機プログラムシステムを開発した。これらを用い、シンクロトロン放射光による異常分散効果を最適化した回折データを微小蛋白質結晶について測定し、抗体など3種の蛋白質の結晶構造を解析した。
ダンシルリジンに結合するマウス抗体のFvフラグメントについて、多波長異常分散法用の回折データ処理と異常分散項の算出処理のプログラムを用いて解析を進めた。その結果、異常分散パターソン合成による相補性決定部位のメチオニンに結合した白金のサイトを得ることができた。その後、分子置換法とモデル精密化法を併用してこのFvフラグメントの結晶構造を1.6A分解能という抗体では最も高い精度で解析を完了することができた。白色X線による異常分散効果の測定系と処理系も新たに開発し、ラウエ回折法に基づく今後の時分割実験による動的構造研究でも適用可能となった。
マウス抗ニトロフェノール(NP)抗体3B44のFavフラグメンの微小結晶について、開発した検出装置を用いることにより3A分解能の回折データを得ることができた。このものの臭素化NPとの複合体の多波長データでは臭素化NPの結合が十分でなかったため分子置換法を適用し、3A分解能で構造解析に成功した。また、抗体NIG9のFabでも結晶が微小で従来法では回折データが得られなかったが、開発した測定処理系によって2.5A分解能の良好なデータを得た。さらに、リボヌクレアーゼU_2も1.8A分解能での解析を完了した。このものの異常分散差フーリエ合成ではイオウ原子のみを明瞭に電子密度として見いだすことができた。

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1990 - 1992

【配分額】17,500千円 (直接経費: 17,500千円)