【研究領域課題番号】21H02127 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核酸 / 生合成 / 放線菌 / ヌクレオチド / 遺伝子 / 酵素 / 核酸系化合物 / 反応機構

【研究成果の概要】

本研究課題では、核酸系天然化合物の生合成酵素の精密機能解析を行い、得られた機能情報をもとに各種生合成酵素の理論的機能改変を行うことで新規な核酸系化合物を創出することを目的としている。2021年度ではまず、放線菌Streptomyces angustmyceticus NBRC 3934株の生産するangustmycin類の生合成機構の詳細を明らかにし、次いでこの生合成機構を改変することで、angustmycin誘導体の生産系の構築を行うことを目指した。それまでに、新規脱水酵素Agm6がangutmycin Cからangustmycin Aへの鍵変換反応を担い、特異な構造であるexo-glycalを形成することを見出した。そこで、Agm6をコードする遺伝子の周辺を探索することにより、angutmycin Cの生合成に関与する遺伝子の機能解析を行った。その結果、agm1からagm6の6個の遺伝子によって生合成されることを、これら6個の遺伝子を異種放線菌であるStreptomyces albusに導入したところangutmycin Cとangustmycin Aの生産が確認されたことから結論づけることができた。また、Streptomyces decoyicusのゲノム配列にも、agm1からagm6の相同遺伝子が存在することも明らかにした。さらには、脱水酵素Agm6がangutmycin Cからangustmycin Aへの変換反応を触媒する際に必要な補酵素はNAD+であり、NADP+は機能しないことも明らかにした。
本研究成果は、核酸系抗生物質angustmycinの生合成遺伝子を初めて同定し、その生合成経路を推定したものである。また、天然化合物としては稀なexo-glycal構造の形成機構を明らかにしたものとして重要である。これらの成果をまとめて、The Journal of Antibiotics誌で発表した。別の核酸系天然化合物であるA-94964の立体化学については、国際共著として発表することができた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】16K14673 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

lncRNA / 細胞分裂 / 次世代シークエンス / 紡錘体 / 中心体 / 遺伝子 / 核酸 / 癌 / 生体分子

【研究成果の概要】

近年、非コードRNA（lncRNA）が様々な生理現象に関与していることが明らかにされてきた。過去の知見から中心体-分裂期紡錘体の形成に関与するlncRNAの存在は実験的に示唆されていたが、その同定には至っていなかった。本研究では、中心体-分裂期紡錘体系に局在するlncRNAを生化学的手法と次世代シークエンスを融合することで網羅的に同定することを試みた。結果として、分裂期紡錘体形成に関与するlncRNAを一つと中心小体先端部の形成に関与するlncRNAを一つ同定することに成功した。現在は、lncRNAが中心体機能をどのように制御することで紡錘体形成に関与しているか解析を進めている。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】神経内科学

【研究領域課題番号】16H05320 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

神経変性疾患 / RNA結合タンパク質 / 細胞死 / 脳神経組織 / 核酸 / 遺伝子 / 神経科学 / 細胞・組織 / 脳神経疾患

【研究成果の概要】

近年、複数の神経変性疾患において、RNA結合タンパク質 (RBP)の代謝障害が発症病態に関与していることが示唆されている。しかし、多くのRBPは脳脊髄組織を含めた全身に幅広く分布しており、なぜ特定の神経細胞だけがこれらの環境変化に脆弱であるのか未解明である。このため本研究では、マウスの特定の神経細胞に発現するRNAだけを標識する技術を導入し、各神経細胞に発現するRNAの特徴を明らかにする手法の確立を目指した。その結果、比較的数の多い神経細胞についてはその細胞の特徴を捉えることに成功した。今後、より少数の神経細胞にも適用可能に改良し、選択的神経細胞死のメカニズムを解明する。

【研究の社会的意義】

本研究成果は、現時点ではまだ開発途上にあるが、最終的にはRBPを介した選択的神経細胞死のメカニズムの解明に高く貢献しうる。その結果、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)や脊髄小脳変性症など数多くのRBPの代謝障害が発症病態の背景にある神経難病の原因を解明し、治療法開発へと役立つ。また、神経難病以外でもRBPが関与する疾患の研究に応用も可能である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】ゲノム生物学

【研究領域課題番号】15H04319 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

CRISPR / dCas9 / base-pairing / thermodynamics / melting temperature / バイオテクノロジー / 遺伝子 / 核酸 / ゲノム / RNA

【研究成果の概要】

本研究は、CRISPR法の改良による次世代型ヒト遺伝子機能解明のための基盤技術の開発を目的とした研究である。CRISPRシステムとは、原核生物の免疫防御システムを利用した新しいゲノム編集法であり、あらゆる生物種に応用可能な画期的技術として注目されている。CRISPR法では、標的部位を塩基配列で識別するガイドRNAがCas9たんぱく質と複合体を形成し、ガイドRNAが対合したゲノム領域をCas9が切断する。そのため、本研究ではゲノム切断活性を伴わないdCas9を用い、実験的手法とバイオインフォマティックスを用いた手法を組み合わせることで、ゲノム編集効率が高く実用的な手法を確立することに成功した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】19,110千円 (直接経費: 14,700千円、間接経費: 4,410千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】25293073 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

酵素 / 遺伝子 / 核酸 / 生体分子 / 発現制御 / メチル化 / 長鎖非コードRNA

【研究成果の概要】

我々はcyclin D1遺伝子プロモーターから転写される非コードRNA(プロモーター由来ncRNA-D)が、RNA結合タンパク質TLSとの結合を介してその遺伝子発現を抑制することを示した(Nature 454:126-30,2008)。TLSはpncRNA-Dの5末端側32-62を標的としていた。この領域は3末端側でステム-ループ構造をとるが、TLSは5末端32-44の直鎖状部分に強く結合していた。さらに、HeLa細胞の高浸透圧処理により、pncRNA-Dのアデノシン特異的メチル化が低下すると、逆にTLS結合が上昇した。現在、TLSのメチル化とRNA結合についても鋭意解析を進めている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】ゲノム生物学

【研究領域課題番号】23510234 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

mRNA品質管理 / 生殖細胞 / エキソン連結部複合体 / 細胞質スプライシング / 線虫 / 異常スプライシング / 性決定遺伝子 / RNA品質管理 / 遺伝子 / 核酸 / ゲノム / 発現制御 / 性決定

【研究成果の概要】

mRNA前駆体のスプライシング後のエキソン連結部に形成されるエキソン連結部複合体（EJC）の構成タンパク質であるY14の発現を阻害した線虫C. elegansでは、イントロンを含むスプライシング未完了RNAが細胞質に漏出することが明らかになった。さらに、これらのスプライシング未完了RNAの中には、細胞質において小胞体タンパク質IRE-1によってプロセシングを受けるものが存在することが示唆された。以上の結果は、Y14を含むEJC中核因子がイントロンを含むRNAの核外漏出を防ぐことによって、遺伝子発現の正確性を保証するゲートキーパーとしての新規機能を持つことを示唆している。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2011 - 2013

【配分額】5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円)

【研究分野】神経内科学

【研究領域課題番号】23659461 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

酵素 / 遺伝子 / 核酸 / 生体分子 / 発現制御

【研究成果の概要】

RNA 結合タンパク質 TLS は筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因遺伝子として報告された。 この ALS 変異型 TLS には、アルギニン特異的(ARG)メチル化酵素 PRMT5 の結合が消失していた。そこで、変異型 TLS は ARG メチル化消失とそれに伴うタンパク質結合の異常から、不溶性凝集体を形成して ALS を発症する仮説を立てた。本研究の目的は、この仮説の検証と変異型 TLS の PRMT5 結合を回復させる RNA リガンド作成である。今回、TLS の ARG メチル化機構の詳細を明らかにし、RNA リガンド候補を得ることに成功した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】22687014 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核酸 / 蛋白質 / 発現制御 / 生体分子 / 遺伝子

【研究成果の概要】

siRNAやmicroRNAなどの小分子RNAは、Argonauteと呼ばれるタンパク質とRISCと呼ばれるエフェクター複合体を形成して機能する。本研究では、小分子RNA二本鎖をArgonauteに取り込まれる際に、Hsc70/Hsp90を中心とするシャペロンマシナリーの働きが必須であることを示し、さらに、シャペロンを含む7つの因子によってRISCの形成過程を試験管内で再構成することに成功した。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】24,700千円 (直接経費: 19,000千円、間接経費: 5,700千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】22390057 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

酵素 / 遺伝子 / 核酸 / 生体分子 / 発現制御

【研究成果の概要】

我々は、 cyclin D1 遺伝子プロモーターから転写される(promoter-derived noncoding: pnc)RNA が、その発現を抑制することを発見した(Nature 454: 126-30, 2008)。この pncRNA の転写開始点を決定し、pncRNA の転写を誘導するタンパク質の精製を試みた。その結果 DNA 修復系タンパク質 5 種類と核構造体 paraspeckle 構成タンパク質 2種類の合計 7 種類のタンパク質が同定された。この成果は、 pncRNA 転写には DNA 修復系が関与し、転写の場は paraspeckle であることを示唆している。この成果は、ncRNA 転写に新境地を開拓することになる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】18,850千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 4,350千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】20390083 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子 / 核酸 / 癌 / 発現制御

【研究成果の概要】

本研究では、ヒストンH3分子のトレオニン11のリン酸化がDNA損傷に応答したE2F 標的遺伝子群の発現制御に重要な役割を果たしていることを明らかにした。DNA損傷非存在下においてはE2F 転写因子にChk1/GCN5複合体が結合し、トレオニン11のリン酸化とリジン9のアセチル化を誘導してE2F標的遺伝子の転写を活性化していることが分かった。DNA損傷がおこるとChk1/GCN5 複合体が解離し、かわりにRb/PP1ガンマー/HDAC3複合体が結合し、トレオニン11の脱リン酸化とリジン9の脱アセチル化を協調して制御することでE2F標的遺伝子の転写を不活性化することを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2008 - 2010

【配分額】19,630千円 (直接経費: 15,100千円、間接経費: 4,530千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】19687011 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

核酸 / 蛋白質 / 発現制御 / 生体分子 / 遺伝子 / microRNA / Argonaute / RISC / 小分子RNA / small RNA / miRNA / siRNA / 翻訳抑制 / ショウジョウバエ

【研究成果の概要】

我々は、ショウジョウバエAgo1はATP依存的なpoly(A)の短縮化に加えて、cap認識後の段階を阻害するのに対し、Ago2はeIF4EとeIF4Gの相互作用を阻害しcap機能を遮断するというように、Ago1とAgo2によるmiRNAを介した翻訳抑制の様式に大きな違いがあることを明らかにした。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2007 - 2009

【配分額】24,960千円 (直接経費: 19,200千円、間接経費: 5,760千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】13490021 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

遺伝子 / 遺伝子運搬 / 人工グリコウイルス / 糖クラスター / ガラクトース / 細胞認識 / プロテオグリカン / 細胞接着 / 人工ウイルス / 肝細胞 / エンドサイトーシス / 量子ドット / コンドロイチン硫酸 / 遺伝子診断 / ナノパーティクル / 水素結合 / 核酸 / 遺伝子導入 / 細胞 / トランスフェクション / 薬物運搬 / ルシフェラーゼ / 受容体

【研究成果の概要】

大環状(カリックスレゾルカレン)骨格に8個の糖鎖を配置したクラスター化合物をホスト(補足剤)/キャリア(運搬剤)とするデリバリーシステムを構築し、細胞認識の仕組みを明らかにした。主な成果は以下のとおりである。
(1)糖クラスターは会合数6程度のミセル様会合体を形成し、これはリン酸イオンにより凝集する。その駆動力は脱水和に基づくエントロピー獲得である。
(2)糖クラスターは核酸(プラスミドDNA)とも強く結合し、サイズが規制(約50nm)された人工"グリコウイルス"を与え、各種細胞にエンドサイトーシスにより取り込まれ(トランスフェクション)、プラスミドにコードされたタンパク質を発現する。
(3)エンドサイトーシスはサイズ依存的であり、最適サイズは約50nmである。末端糖鎖がガラクトースの場合、人工ウイルスはさらに会合し、トランスフェクション活性は低下する。一方、ガラクトースウイルスは肝細胞に対して受容体を介する経路で特異的に取り込まれる。このように、肝細胞に対して特異性を有するが、全体の活性(トランスフェクション効率)は低い。
(4)ガラクトースを部分的に有する人工ウイルスは会合を起こさず、肝細胞に対する高い選択性を保持しており、in vitroのみならずin vivo(マウス)においても高い肝臓指向性を有する。
(5)このように、糖鎖の数を考慮した単量体ガラクトースウイルスを用いることにより、高度の肝細胞指向性遺伝子運搬システムの構築に成功した。
(6)一方、細胞外マトリックス成分であるプロテオグリカンの機能に着目し、コンドロイチン硫酸を複数個置換した大環状プロテオグリカン類似体を合成し、これが糖クラスターのタンパク安定化効果により著しい細胞接着阻害効果を有することを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2003

【配分額】16,000千円 (直接経費: 16,000千円)