【研究領域課題番号】21K14468 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオテクノロジー / タンパク質 / バイオセンサー / 蛍光 / mRNA-display

【研究種目】若手研究

【研究期間】2021-04-01 - 2023-03-31

【配分額】3,510千円 (直接経費: 2,700千円、間接経費: 810千円)

【研究領域課題番号】20H04535 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / 核酸 / 癌 / バイオテクノロジー / 共焦点顕微鏡

【研究成果の概要】

本研究計画では、これまで創薬ターゲットとすることが困難であったがん細胞内の疾患標的に結合するバイオ医薬を、がん細胞選択的に細胞内に送達させることで、２重の鍵をもつきわめて副作用の少ないがん細胞選択的膜透過バイオ医薬を開発することを目的としている。細胞内の疾患標的に対するバイオ医薬として、mRNAディスプレイ法により当研究室で作製済みのアンドロゲン受容体（AR）スプライスバリアント7 (AR-V7) に対する小型ドメイン抗体を用いるが、抗体医薬だけではなくペプチド医薬や核酸医薬についても並行して検討することでリスクヘッジすることを計画している。
まず、核酸医薬として、AR-V7に対するsiRNAとAgo2タンパク質とのRNA-タンパク質複合体を細胞質に効率よく送達させるために、独自のヒトSyncytin1由来膜透過促進ペプチドを融合したAgo2タンパク質を昆虫細胞で大量発現・精製し、ヒト培養細胞に添加した結果、ARおよびAR-V7遺伝子の共通部分配列に対するsiRNAを用いた場合に、標的遺伝子が従来法よりも効率よくノックダウンされることをRT-qPCRにより確認できた（論文投稿中）。
また、ペプチド医薬のモデルとして、アポトーシス誘導ペプチドを細胞選択的に細胞質に送達させるために、膜透過促進ペプチドをLDL受容体結合ペプチドとともにアポトーシス誘導ペプチドに融合したタンパク質を大腸菌で大量発現・精製し、ヒト培養細胞に添加したところ、LDL受容体発現細胞選択的な細胞生存率の減少とアポトーシス誘導によるカスパーゼの切断を確認できた（学会発表済み、論文投稿中）。
さらに、AR-V7に対する抗体医薬をがん細胞選択的に細胞内デリバリーするために、初年度は、様々ながん細胞で高発現しているEGFRを認識する人工ペプチドリガンドおよび小型抗体をmRNAディスプレイ法により試験管内選択した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2024-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】農業環境・情報工学

【研究領域課題番号】17H03893 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

環境制御 / バイオ医薬品 / 植物工場 / 一過性遺伝子発現 / ベンサミアナタバコ / インフルエンザワクチン / ヘマグルチニン / 温室 / 人工光型植物工場 / 遺伝子発現 / 小胞体ストレス / 植物利用型有用タンパク質生産 / 二酸化炭素施用 / 農業工学 / 環境 / 植物 / バイオテクノロジー / 蛋白質

【研究成果の概要】

一過性遺伝子発現法を用いた植物利用型有用タンパク質生産における，遺伝子導入前後の栽培環境条件の影響，および遺伝子導入後の気温が有用タンパク質生産量に及ぼす影響のメカニズムを明らかにすることを目的とした。遺伝子導入後の高PPFDおよび高CO2濃度がヘマグルチニン（HA）生産に必ずしも効果的ではないこと，および遺伝子導入前のPPFDおよび気温制御が遺伝子導入後のHA生産にとって重要であることが明らかとなった。また，遺伝子導入後に特定の気温条件で観察される葉のネクロシスに小胞体ストレスが関与することが示唆された。

【研究の社会的意義】

一過性遺伝子発現法を用いた植物利用型有用タンパク質生産において，遺伝子導入前後の環境制御の効果と，その効果の合理的解釈に関する知見が得られた。また，遺伝子発現の定量解析により，環境制御の効果をもたらす生理的メカニズムの一端が明らかになった。いずれも，実用的な植物利用型有用タンパク質生産において有用な知見となりうると考える。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】生体医工学・生体材料学

【研究領域課題番号】17H02103 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

抗体 / ペプチド / 核酸 / ドラッグデリバリーシステム / 細胞膜透過 / 蛋白質 / 癌 / バイオテクノロジー / 共焦点顕微鏡

【研究成果の概要】

標的分子に対して高い特異性と親和性をもつ抗体／ペプチド／核酸などのバイオ医薬は、従来の低分子化合物医薬と比べて副作用が少なく、治療効果が高い究極の分子標的薬として注目されているが、細胞膜透過性が低いという欠点があり、効率のよいドラッグデリバリーシステム（DDS）の開発が求められていた。本研究では、我々が発見した膜透過促進ペプチドを利用して、抗体／ペプチド／核酸を従来よりも効率よく細胞質に送達できることを示した。また、基礎研究として、その膜透過促進メカニズムの解明も並行して進めた。

【研究の社会的意義】

我々が発見した膜透過促進ペプチドはヒト天然タンパク質由来であり免疫原性の懸念が少ないという利点もあることから、この独自の膜透過促進ペプチドを連結した抗体／ペプチド／核酸がヒト細胞の細胞質に効率よく送達されるという本研究の成果は、将来的に、細胞内の疾患標的に作用する新しい抗体医薬の開発や、ペプチドや核酸からなる中分子医薬の効率的なデリバリーに応用することが期待できる。これにより、我が国のバイオ創薬技術の基盤強化、ひいては国民の医療・福祉の向上に大きく貢献することが期待できる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】17H03975 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオ医薬 / 抗体医薬 / 安定性 / 凝集 / タンパク質 / 界面 / 免疫原性 / 分析 / バイオ医薬品 / 蛋白質 / 凝集体 / 質量分析 / 立体構造 / 抗体 / 免疫複合体 / TNF / 超遠心分析 / 沈降速度法 / 生体分子 / 薬学 / シグナル伝達 / バイオテクノロジー

【研究成果の概要】

本研究によりバイオ医薬品で発生するタンパク質凝集体の定量的解析手法が確立し、凝集の原因となるストレスの特定に成功し、さらに凝集体の免疫原性との関連性について解明することができた。とくに、プレフィルドシリンジに塗布されたシリコンオイルとタンパク質が複合体となった際の免疫原性への影響は顕著であり、製剤における容器設計の重要性がより明確となった。また、従来から提唱されてきた、コロイド安定性と構造安定性に加えて、界面安定性の向上が凝集体発生の抑制には需要であることを示すことができた。さらに今回見出した振動や衝撃がタンパク質凝集を引き起こす点も医薬品の安定性を高める上で非常に有益であるといえる。

【研究の社会的意義】

本研究は、近年、利用されているバイオ医薬品の安定性と安全性に関するものであるが、これまで不明点が多かったタンパク質凝集体と副作用の関係を実験的に示唆することができた社会的意義の大きい研究成果である。特に、製薬企業から医療現場で利用される実際の場面へとフィードバックが可能な知見が数多く含まれており、かつ、応急処置的な対応では無く、包括的かつ根本的に医薬品の安定性を高めることが可能となることから、科学的意義は当然ながら、産業的意義が大きいといえる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】16,380千円 (直接経費: 12,600千円、間接経費: 3,780千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】16H04580 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質工学 / 腫瘍免疫学 / 化学修飾 / バイオテクノロジー / コンパニオン診断薬 / がん免疫治療 / 個別化医療 / 生物工学 / 診断薬 / バイオマーカー / がん抗原 / 抗体検査 / 腫瘍免疫応答 / 蛋白質 / 癌 / 免疫学 / 生体分子

【研究成果の概要】

末梢血に含まれるがん抗原に対する自己抗体をバイオマーカーとして、個人差が大きいがんに対する免疫応答を的確に予測・モニタリングする技術開発に取り組んだ。150種類超の全長ヒトがん抗原の生産リソースを整備し、水溶性で全エピトープを露出するS-カチオン化抗原とluminex法を組み合わせた診断薬プロトタイプを完成した。実際にがん免疫サイクルの活性化を反映する自己抗体の変動を鋭敏に観察することに成功した。

【研究の社会的意義】

変性状態のタンパク質を可溶化する独自開発技術をベースとして、がん免疫治療をサポートできる診断薬開発が進捗した。腫瘍免疫応答は個人差が大きく現状では予測・評価が困難である。本研究で開発した自己抗体定量システムは、ごく微量の末梢血でがん免疫サイクルの活性化レベルを定量評価でき、治療方針の選択に活用できる可能性がある。本研究成果をベースに診断薬の実用化を加速したい。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】医化学一般

【研究領域課題番号】16K15212 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

非コードRNA / 蛋白質 / 機能性RNA / 核酸 / 細胞 / 生体分子 / バイオテクノロジー / プロテオーム

【研究成果の概要】

近年、miRNAやlncRNA等に代表されるノンコーディング(nc)RNAが、細胞内で核酸や蛋白質と相互作用して、多彩な生命機能の制御に寄与すること、また、その異常が疾病発症に関与することが明らかにされ、注目を集めている。しかし、個々のncRNAの機能に関しては依然として不明な点が多い。本研究では、ncRNAの機能解析に資する新たな基盤技術の確立を目指して、生細胞内でncRNAと特異的に結合する分子を網羅的に同定する実験法の開発に挑戦し、新規システムを樹立することに成功した。本法はncRNAに限らずmRNAの解析にも広く適用可能であると考えられ、当該分野の発展に大きく貢献することが期待される。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2016-04-01 - 2018-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】生体医工学・生体材料学

【研究領域課題番号】15K12545 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

膜融合ペプチド / 免疫原性 / mRNAディスプレイ / pH応答性一本鎖抗体 / 試験管内進化 / 細胞内抗体医薬 / 中分子医薬 / ドラッグデリバリーシステム / 蛋白質 / 進化 / バイオテクノロジー / 免疫学 / 共焦点顕微鏡

【研究成果の概要】

受精や胎盤形成における細胞膜融合に関与するタンパク質の部分ペプチドが、様々な高分子の人為的な膜透過を促進するツールとして利用できる可能性を提唱し、従来の細胞膜透過性ペプチドによるタンパク質の細胞質送達効率を数十倍向上させることができ、かつ、免疫原性の懸念がないヒト由来の膜透過促進ペプチドを発見した。また、我々が開発したPURE mRNAディスプレイ法を用いて、膜抗原に中性pH（細胞外）で結合し酸性pH（エンドソーム内）で解離するpH応答性の一本鎖抗体の試験管内進化に成功した。膜透過促進ペプチドとpH応答性抗体とを融合することで、バイオ医薬の細胞選択的なデリバリーシステムへの応用が期待できる。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】15H04191 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオセンサー / バイオテクノロジー / 抗体 / 抗原 / 蛍光 / クエンチ / ケミカルバイオロジー / 部位特異的修飾 / 結合タンパク質 / 蛋白質 / 免疫学 / プロテオーム / マイクロアレイ / タンパク質

【研究成果の概要】

従来の免疫測定法には，測定に多数のステップと最低数時間の時間を要する問題があった。我々は最近，組み換え抗体を用いた蛍光免疫センサータンパク質Quenchbody (Q-body)の構築原理を見いだし，サンプルと混合するだけで低分子からタンパク質まで多くの目的物質（抗原）を蛍光検出することに成功した。今回，その動作原理を精査することで，組換え抗体のみならず天然抗体をもQ-body化しうる方法論を複数確立した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)

【研究分野】生物分子化学

【研究領域課題番号】26560433 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質工学 / ケミカルバイオロジー / 一酸化炭素 / フェリチン / バクテリオファージ　T４ / タンパク質 / 生体材料 / ナノバイオ / バイオテクノロジー / 分子機械 / 蛋白質

【研究成果の概要】

今回の研究により、（１）タンパク質複合体のCO輸送体としての有用性、（２）針タンパク質の表面電荷改変によるハエ幼虫脳への集積制御が達成された。同時に、今後の課題として、ROSやNO研究の前例があるeye discを用いた評価、また、ROSのイメージングに加え、抗体染色によるHOやNOSの発現評価、COの関与する酵素sGCの活性阻害評価によって器官やモデル個体を用いた詳細な検討を進めていく。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2016-03-31

【配分額】3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】26630426 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リポソーム / ナノファイバー / 膜タンパク質 / ナノバイオ / バイオテクノロジー / 蛋白質

【研究成果の概要】

本研究の目的は、Acinetobacter sp. Tol 5細胞上の接着性ナノファイバータンパク質AtaAをリポソーム内部で合成し、表面に生やすことである。我々は、AtaAの基本構造を損なわずに正しくフォールディングされる縮小版ataAの遺伝子を作成し、無細胞タンパク質合成系でのポリペプチド鎖の合成を確認した。次に、縮小ataA遺伝子を細胞サイズのジャイアント・シングルラメラ・リポソーム内部で発現させ、縮小版AtaAタンパク質の合成とリポソーム表層提示を試みた。フローサイトメトリ－により、抗体蛍光標識した縮小版AtaAが極微量提示されている可能性が示されたが、確実と言えるレベルではなかった。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2014-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】26289310 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / ナノ粒子 / DDS / 抗がん / 生体機能材料 / バイオテクノロジー / 生体分子 / ナノバイオ / 生体機能利用 / 蛋白質

【研究成果の概要】

疎水性温度応答性ポリペプチドとポリアスパラギン酸の融合タンパク質が、加温により直径30 nm程度の均一なナノスフィアを形成することが明らかとなった。このナノスフィアは、分子設計により表面に任意の機能タンパク質を提示することが可能であり、内部は疎水性コアを形成するため、疎水性化合物を容易に内包することができる。これを利用してがん細胞への特異的送達を行うため、表面に分子認識機能を有する分子を提示し、内部には抗がん剤を包含したタンパク質ナノスフィアを構築した。これらタンパク質ナノスフィアは、がん細胞を特異的に認識することができ、がん細胞に到達後は内部の薬剤を放出し殺傷できることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2018-03-31

【配分額】15,990千円 (直接経費: 12,300千円、間接経費: 3,690千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】25289298 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / 進化 / バイオテクノロジー / がん / 免疫学

【研究成果の概要】

本研究では、以前に当研究室で開発された無細胞ディスプレイ技術を応用・発展させることにより、高いエフェクター機能や二重特異性などの新たな機能を付与した次世代低分子抗体医薬を簡便かつ迅速に開発できるシステムを確立することを目指し、以下の成果を得た。(1) 従来のmRNAディスプレイ法を用いて、新規のFc受容体結合ペプチドを同定した。(2) 無細胞翻訳系としてPUREシステムを用いたmRNAディスプレイ法を確立し、抗GPCRヒト一本鎖抗体の試験管内選択に成功した。(3) 共有結合型DNAディスプレイ法を確立し、耐熱性Fab抗体の試験管内進化と二重特異性Diabody抗体の試験管内選択に応用した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】23360370 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質工学 / 化学修飾 / バイオテクノロジー / 腫瘍免疫 / 診断薬 / ワクチン / 蛋白質工学 / がん免疫 / CT抗原 / 蛋白質生産 / タンパク質化学 / タンパク質生産 / タンパク質 / タンパク質精製 / 細胞内導入

【研究成果の概要】

本研究では、化学修飾法を用いた変性タンパク質のタンパク質可溶化技術を活用して、多くが不安定な物性のがん抗原タンパク質を全長・水溶性として調製する技術開発とリソース強化を進めた。本抗原を活用して、高感度な抗体検査試薬のプロトタイプ開発に成功し、がん免疫活性の診断薬となる可能性が示された。これらのリソース整備と周辺技術の組み合わせにより、タンパク質カチオン化技術のがん免疫治療分野への活用に向けた基盤が整った。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2011-04-01 - 2014-03-31

【配分額】18,330千円 (直接経費: 14,100千円、間接経費: 4,230千円)

【研究分野】応用分子細胞生物学

【研究領域課題番号】22658111 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロテオーム / 蛋白質 / 遺伝子 / バイオテクノロジー / 発現制御

【研究成果の概要】

プロテインマイクロアレイは、1枚のスライド上に数千種類のタンパク質を固定したもので、大規模なタンパク質相互作用の検出などに利用されている。我々は、鋳型DNAと抗体をスライド上に固定し、スライド上でタンパク質を合成・捕捉するオンチップ転写翻訳マイクロアレイを開発した。さらに我々は、1つのスポット内で2種類のタンパク質を同時に発現させ、相互作用解析を行うオンチップ共発現マイクロアレイを開発した。この手法では解析するタンパク質をマトリックス状に組み合わせることで、1枚のスライド上で多対多の相互作用解析が可能となる。この系を用いて、転写因子Junとその結合候補因子群をモデルとして、タンパク質間およびタンパク質・DNA相互作用の検出に成功した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】3,590千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 390千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】22360351 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ウイルス / バイオテクノロジー / 免疫学 / 蛋白質 / 進化

【研究成果の概要】

本研究では、当研究室で開発されたmRNAディスプレイ法を用いて、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)侵入阻害剤の重要な標的となっているCCR5の第2細胞外ループを模倣した環状ペプチドに対して高い親和性を有するヒト化一本鎖抗体の試験管内進化をおこなった。その結果、VL鎖のCDR1に重複した変異をもつ、高親和性変異体が得られた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】19,240千円 (直接経費: 14,800千円、間接経費: 4,440千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】17360393 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / バイオテクノロジー / 生体分子 / 生物・生体工学 / 溶媒・添加剤 / アルギニン / 可溶化 / クロマトグラフィー / 凝集会合形成 / フィロールディング / 製剤 / プロテインマニピュレーション / リフォールディング

【研究成果の概要】

新規な蛋白質可溶化・調製法確立への,アミノ酸とその誘導体導入の具体的展開をさらに強固なものとするために,アルギニンとその誘導体の持つ蛋白質凝集抑制に関する作用機序の解明ならびに凝集体可溶化メカニズムへのアプローチについて,以下の観点から研究を進めた.
L-アルギニンとその誘導体の作用機序の解明:1)密度計を用いた溶解度測定によるL-アルギニン誘導体と各種アミノ酸,ペプチド結合との親和性の測定から,誘導体の性質によって,目的の機能向上が可能になることを示した.2)2種類の蛋白質のL-アルギニン存在下における結晶構造解析から,アルギニンが水和構造安定化に大きく寄与すること,蛋白質の高次構造にその作用機序が強く依存することを示した.
L-アルギニンとその誘導体を用いた蛋白質の可溶化:シグナル伝達系蛋白質数種類について,L-アルギニンとその誘導体を用いて発現した封入体の可溶化を試み,アルギニンの有用性を示すことができた.各種熱量測定からその安定性・機能の記述に成功した。以上の結果から,アルギニンとその誘導体を用いた蛋白質の可溶化法を確立した.
各種Chromatographyへの具体的展開:ゲルろ過(GPC),疎水的相互作用クロマトグラフィー(HIC),イオン交換クロマトグラフィー(IEX),色素親和性クロマトグラフィー(Dye),抗体を中心とした各種親和性クロマトグラフィーにおいて展開溶媒としてのアルギニンの有用性を確固たるものにした.
以上の結果から,アルギニンの持つ特殊な化学構造(グアニジウム基とアミノ酸)をたくみに利用することにより,蛋白質表面構造への作用機序を変化させ,汎用性の高い蛋白質ハンドリングに適用可能であることを示し,解析が困難な蛋白質に対する可溶化・調製システムの基盤を築くことができた.

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】16,430千円 (直接経費: 15,500千円、間接経費: 930千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】16360407 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオセンシング / 細胞 / ヒスタミン / バイオテクノロジー / タンパク質 / 生体材料 / 生物生体工学 / 蛋白質 / 細胞バイオセンシング / インテリジェント材料 / 疎水性人工タンパク質 / 一酸化窒素 / 細胞接着タンパク質

【研究成果の概要】

細胞は基本的に増殖することが可能であり、様々な成長因子などの作用によって分化することもできる。また環境変化による自分自身へのダメージを診断・修復する機構も備えており、細胞の内外で様々な情報伝達を行っている。細胞はこのような自己修復・自己診断・環境応答といった「インテリジェンス性」を持っているため、細胞を材料として用いることにより、きわめて高度なインテリジェントバイオセンシングシステムを実現できる可能性がある。特に細胞の持つ「環境応答機能」は、細胞周辺の物理的な環境変化のみならず、化学物質によっても発現される。本申請課題は、この化学物質による細胞応答を測定することによって化学物質が生体に与える影響を測定する「インテリジェント細胞バイオセンシングシステム」を創出することを目的として行った。
前年度まで主として一酸化窒素(NO)を指標として、血管内皮細胞に薬物刺激を与えたときのNO放出挙動を測定することにより、細胞バイオセンシングシステムを作製してきた。本年度の研究では、ここで開発した細胞バイオセンシングシステムの基本原理に基づいてその汎用性を示すため、免疫系細胞とヒスタミンオキシダーゼを組み合わせることにより、アレルギー物質に対する細胞バイオセンシングシステムの構築を試みた。このためまず、ここで使用するヒスタミンの酸化酵素であるヒスタミンオキシダーゼの遺伝子発現・精製を行い、基本的な電気化学的特性を評価した。次いで、本システムでアレルギー物質に応答してヒスタミンを放出する細胞を培養し、この細胞が化学物質刺激により放出するヒスタミンを、オキシダーゼにより酸化し細胞と一体化した電極上で電気化学的に検出した。
以上の結果、構築したインテリジェント細胞バイオセンシングシステムが、生細胞に影響を与える化学物質の評価に有用であることが明らかとなった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】14,000千円 (直接経費: 14,000千円)

【研究分野】生物・生体工学

【研究領域課題番号】12650783 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生物・生体工学 / バイオテクノロジー / タンパク質 / 多糖分解酵素 / 極限微生物 / 好アルカリ性細菌 / キシラン / キシラナーゼ / 触媒ドメイン / キシラン結合ドメイン / ファージディスプレイ / 進化分子工学 / タンパク質工学 / 反応至適pH

【研究成果の概要】

好アルカリ性バシラス属細菌41M-1株に由来するキシラナーゼ(多糖キシランの加水分解酵素)に注目し,その好アルカリ性機構および基質認識・識別機構の分子レベルでの解明と,反応至適pHならびに基質特異性の変換を目的として,以下の研究を実施した。
(1)触媒ドメインに存在する基質の認識・識別に関与するアミノ酸残基の特定
41M-1株キシラナーゼの触媒残基近傍にアミノ酸置換を導入した各種変異型酵素を調製し,その基質キシランとの相互作用を調べることにより,本酵素の基質認識・識別に関与する芳香族アミノ酸残基を特定することができた。
(2)触媒ドメインに存在する反応至適pHに関与するアミノ酸残基の特定
41M-1株キシラナーゼの触媒ドメインにある種のアミノ酸置換を導入することにより,反応至適pHが酸性側に大きくシフトすることがわかり,本酵素の好アルカリ性に関与するアミノ酸残基を明らかにすることができた。
(3)キシラン結合ドメインのキシラン認識機構の解明
41M-1株キシラナーゼのキシラン結合ドメインをコードする遺伝子にランダム変異を導入し,ファージディスプレイした後,キシランへの結合能を失ったファージを選抜した。キシランへの結合能を失ったキシラン結合ドメインにおける変異導入箇所を調べることにより,キシラン認識に関与するアミノ酸残基を特定することができた。また,41M-1株キシラナーゼのキシラン結合ドメインは,キシランを単糖レベルおよびオリゴ糖レベルの両方で認識・結合することを明らかにした。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)