【研究領域課題番号】18K08894 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

敗血症性ショック / 敗血症 / テトラヒドロビオプテリン / アスコルビン酸 / 血管内皮細胞 / プテリジン / 一酸化窒素 / 一酸化窒素合成酵素

【研究成果の概要】

敗血症性ショックは、様々な治療法が進歩した救急・集中治療領域においても未だ予後不良の疾患の一つである。本研究は、敗血症におけるテトラヒドロビオプテリン (BH4)とその関連代謝物の変化を解析し、病態との関連を検討することを目的として実施した。BH4とその関連代謝物の血中濃度は、感染からの時間経過とともに変化しており、この変化は一酸化窒素の産生量や病態の変化と関連していることが示唆された。また、敗血症モデルマウスに対し、BH４の酸化防止目的にアスコルビン酸(AsA)の投与を行った結果、生存率が改善した。

【研究の社会的意義】

本研究による成果は、未だ死亡率の高い敗血症性ショックの病態メカニズムの解明につながる。病態メカニズムが解明されることで、これまでは対症療法が主体であった敗血症に対する臨床診療においても、BH4とその関連代謝物を指標とした新しい治療法の確立が期待でき、これによって死亡率の低下を実現できる可能性がある。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】18590801 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

老化 / エイジング / Sir2 / Sirt1 / 心血管疾患 / 動脈硬化 / 内皮機能障害 / 血管内皮細胞 / 一酸化窒素 / 細胞増殖 / 酸化ストレス

【研究成果の概要】

血管老化あるいは血管障害が全身老化の一表現であるという観点から、抗老化作用を有するNAD依存性脱アセチル化酵素Sir2の哺乳類ホモログSirt1が血管老化、血管障害に果たす役割を検討することを本研究の目的とした。まず培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いて、Sirt1阻害による血管内皮細胞の老化形質への影響を検討した。Sirt1阻害薬sirtinolおよびSirt 1 siRNAの処理により、10日目には、老化関連beta-galactosidase (SA-beta-gal)活性の増加、増殖の停止、大型化といった老化形質の発現を認めた。同時に、PAI-1発現の増加、内皮型NO合成酵素(eNOS)の活性低下がみられた。sirtinolおよびSirt 1 siRNAはHUVECにおけるp53のタンパク発現に影響することなくアセチル化を促進した。Sirt1阻害で老化形質を示したHUVECは、増殖因子刺激による細胞内シグナルも減弱していた。これらと逆に、遺伝子導入によりSirt1を過剰発現させると、過酸化水素刺激で誘導したHUVECの早期老化形質はすべて抑制された。次に、Sirt1発現・活性を保持し、内皮細胞老化を抑制する薬剤を探索した。その結果、フォスフォジエステラーゼ3阻害薬のシロスタゾールが、eNOS活性とSirt1発現の保持を介して、過酸化水素刺激で誘導されるHUVECの早期老化形質を抑制することがわかった。これらの結果から、Sirt1は血管内皮細胞の老化を防ぎ、NO産生など内皮細胞機能の維持に作用すると考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2006 - 2007

【配分額】3,880千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 480千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】15590724 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

血管内皮細胞 / カルシウムシグナル / カメレオン / FRET / 一酸化窒素(NO) / イメージング / PLC / カベオラ

【研究成果の概要】

細胞膜直下には多くのCa^<2+>依存性情報伝達分子、Ca^<2+>調節蛋白、膜融合・分泌などのイベントが関連している。従って、膜直下Ca^<2+>の時・空間的調節は細胞機能の多様性を発揮するために必須である。我々は内皮細胞膜直下Ca^<2+>動態を視覚化し、その上昇パターン形成機構の解析と、PKCβおよびPLA_2の膜移行及びNO産生との関連を検討した。Ca^<2+>センサー蛋白カメレオンを培養内皮細胞膜直下にターゲットさせ、Ca^<2+>変化に応じて生じるカメレオン分子内FRETを共焦点顕微鏡によりイメージングした。細胞内IP_3産生はPLCδのPHドメインをGFPに融合したキメラ蛋白の膜から細胞質への移行により評価し、PKCβの細胞質から膜への移行はPKCβ-GFPの細胞質から膜への移行により、NO産生はDAF-2により評価した。細胞外Ca^<2+>濃度を0から1.2mMに上昇させると、細胞の局所よりCa^<2+>流入が開始し、細胞全体へとその流入は毎秒数十μmの速度でwave状に伝搬した。これにはIP_3産生が伴い、PLC阻害薬でIP_3産生およびCa^<2+> waveの伝搬が減弱された。また、この膜直下Ca^<2+>上昇伝に応じてPKCβ-GFPの細胞質から細胞膜への移行が観察され、その程度はATPまたはイオノマイシンで刺激したときの5-10%であった。一方PKCβと同様にC2ドメインによりCa^<2+>依存性にERやゴルジへ移行するPLA_2の移行は細胞外Ca^<2+>変化の影響を受けなかった。さらに、DAF-2を負荷した細胞でNO産生を評価したところ、細胞外Ca^<2+>変化のみでNO産生が影響を受けた(イオノマイシン刺激の5-10%変化)。従って、細胞外Ca^<2+>濃度変化に伴うIP_3産生に依存的して構成される膜直下Ca^<2+>waveは、独立したコンパートメントを伝搬し、PKCβシグナルおよびNO産生にも影響を与えることが明らかにされた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】麻酔・蘇生学

【研究領域課題番号】12877247 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

血小板 / 血管内皮細胞 / 接着分子 / 微小循環 / 吸入麻酔 / 一酸化炭素 / 一酸化窒素

【研究成果の概要】

本研究では、超高速度カメラと血小板染色蛍光色素(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester : CFDASE)を用いて、ラット腸間膜微小循環系における吸入麻酔中の血小板接着反応を生体顕微鏡下で観察・解析した。その結果、セボフルランは毛細血管後細静脈における血小板の辺縁移行(margination)と赤血球速度に対する血小板速度比(V_P/V_R ratio)が低下し血小板-血管内皮細胞接着反応を惹起すること、さらにストレス応答酵素ヘムオキシゲナーゼ-1とその最終ヘム代謝産物であるガス状メディエーター一酸化炭素により抑制されることを初めて明らかにした(Anesthesiology2001;95:192)。また、ハロセン麻酔下においても生体内の血小板動態が不均一であること、血管内皮細胞表面との接着を繰り返していること、さらに可逆性のある麻酔薬惹起性血小板接着現象を確認し、現在投稿中である。以上の研究により、生体外では臨床使用濃度の麻酔薬により抑制される血小板機能は、生体内においてはむしろ賦活化されることを初めて明らかにした。研究者らは以前、白血球接着反応が臨床使用濃度の吸入麻酔により惹起され、組織障害の素因を形成する可能性を示した(Anesthesiology 1997;87:591)。本研究において、麻酔中の血小板動態も白血球とほぼ同様に賦活化されることを示し、現在は血小板が白血球動態にどのような影響を及ぼしているかを検討する計画を立てている。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】800千円 (直接経費: 800千円)

【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】12670652 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

動脈硬化症 / 血管内皮細胞 / 一酸化窒素 / 血管拡張 / 新生内膜 / 血管平滑筋細胞 / 転写調節 / 脱分化

【研究成果の概要】

1.血管壁細胞におけるDDAH IおよびDDAH II遺伝子発現調節の検討
1)DDAH IおよびDDAH IIに対して作成した抗体を用いて、ラット頸動脈擦過モデルによる新生内膜の免疫組織染色を行い、脱分化しているとされる新生内膜の平滑筋細胞におけるこれら酵素の発現増加を認めたこと、中膜平滑筋層から培養系に移した血管平滑筋細胞において両者の発現が著明に上昇したことから、血管平滑筋細胞脱分化と両酵素の発現の関連を詳細に検討した。脱分化度を上昇させSMembの発現が亢進する条件下ではDDAH IおよびDDAH IIの発現も上昇し、両者の発現が脱分化と何らかの関連があることが示唆された。
2.内因性NOS阻害物質ADMA定量による検討
2)本研究において確立した内因性NOS阻害物質ADMAを高速液体クロマトグラフィー蛍光検出法により定量する系を用い、ラットにおいて血圧と血中ADMA濃度の関係を検討した。高血圧自然発症ラットの血中ADMA濃度は対照と差を認めず、また薬剤によって降圧した場合にも血中ADMA濃度に変化を認めなかった。一方、アンジオテンシンIIの昇圧モデルにおいては、血圧と血中ADMA濃度に有意の相関を認めた。
3)睡眠時無呼吸症候群と診断され、持続陽圧呼吸療法により無呼吸発作の改善を図っている患者において、血管内皮機能検査と血中のADMA濃度の両者を検討したところ、持続陽圧呼吸療法により血管内皮機能の有意な改善を認めたが血中ADMA濃度の低下は有意ではなかった。しかし、この対象患者において血管内皮機能と血中ADMA濃度には有意の負の相関が認められた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2000 - 2001

【配分額】2,900千円 (直接経費: 2,900千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】09470143 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

heme oxygenase / 一酸化炭素 / 一酸化窒素 / cytochrome P450 / 伊東細胞 / guanylate cyclase / カルシウム / 肝細胞 / ヘムオキシゲナーゼ / 微小循環 / 血管内皮細胞 / ヘモグロビン

【研究成果の概要】

我々は肝臓で内因性に生成される一酸化炭素(CO)が類洞血管抵抗を生理的レベルに低く保つために必要不可欠である内因性血管弛緩因子であることをラットを用いた実験的研究で世界で初めて明らかにした。この結果を基盤として本研究の平成9、10年度ではCOが肝臓における胆汁酸依存性胆汁輸送の内因性抑制物質であることを明らかにすると同時に、そのメカニズムとして同じガス状物質であるNOのようにミトコンドリアの呼吸鎖の抑制には直接関係せず、胆汁分泌系の起始部である毛細胆管の律動的収縮運動に対する抑制効果が関与すること、その場合COのレセプター分子としてcytochrome P450 epoxygenaseが関与し、細胞内カルシウムの動員抑制が抑制効果の本態であることを明らかにした。この結果はCOの新しい情報伝達系が提示された意義とともに、従来情報伝達系と考えられてきたsoluble guanylate cyclaseを介さない経路が存在することを示唆している点で極めて重要な成績である。一方COの生成酵素であるheme oxygenaseのアイソザイム(HO-1,HO-2)の肝臓における分布は全く明らかにされていなかったが、前者が、類洞内に分布するKupffer cellに、後者が類洞外の肝実質細胞に分布することが新規に作成した単クローン抗体による免疫組織学的検討で明らかにされ、類洞外空間(HO-2)で生成されたCOが血管周皮細胞である伊東細胞を弛緩させて血管抵抗が恒常的に低く保たれることが示された。本酵素のアイソザイムが臓器内の特定の細胞群に特異的に発現していること、それらの生理学的意義が明らかにされたのも初めてのことである。今後、HO-1の転写活性を上昇させる刺激として、低酸素、活性酸素、サイト力インなどの役割に着目し、これらの侵襲因子が上昇することが知られている小児外科領域でのtotal parenteral nutrition使用後のcholestasisや高血圧動物モデルにおける血管トーヌス異常におけるHO反応の役割をさらに検討する予定である。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】5,100千円 (直接経費: 5,100千円)