【研究分野】循環器内科学

【研究領域課題番号】17K09488 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

重症心不全 / 血管内皮機能 / 栄養状態 / サルコペニア / 一酸化窒素 / 呼吸筋疲労 / 補助人工心臓 / 肺拡散能 / 運動療法 / 心臓移植 / 活性酸素 / 心臓リハビリテーション

【研究成果の概要】

重症心不全の対象として補助人工心臓装着の患者、成人先天心疾患の患者にfocusをあて、血管内皮関連の要素、栄養状態、筋力低下と病態との関連を検討した。LVAD装着後の血管内皮機能であるflow-mediated dilationは補助人工心臓の機器依存的に変化した。また補助人工心臓の予後は術前の栄養状態の影響を強くうけ、栄養状態は右心不全状態に依存的であった。またLVAD術前のサルコペニアについて体部CTで評価した骨格筋で算出したところ、LVAD後の経過と関連していた。

【研究の社会的意義】

重症心不全状態は心臓以外の栄養状態や血管内皮機能、サルコペニアと病態が関連することを確認した。重症度の高さから心不全治療では十分に解決できないケースも多い中で、心臓以外の事象との関連を示すことによって、新たな介入ポイントを示唆する結果とも考えられ、今後の新たな治療戦略の開発につながることが期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2017-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】機能系基礎歯科学

【研究領域課題番号】15H05016 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

軟骨細胞 / 骨芽細胞 / 破骨細胞 / 一酸化窒素 / 活性酸素種 / 8-nitro-cGMP / 骨細胞 / 骨代謝 / 8-NO2-cGMP / S-グアニル化 / 硬組織疾患 / 疾患モデルマウス / 硬組織 / 活性酸素 / はタンパク質S-グアニル / 細胞分化 / 細胞増殖

【研究成果の概要】

一酸化窒素および活性酸素種のセカンドメッセンジャーとして発見された8-nitro-cGMPの骨・軟骨における8-nitro-cGMPの生成・機能を解明を目指した。従来、cGMP依存的に骨伸長が誘導されることが知られていたが、我々は、成長板の増殖軟骨層で生成した8-nitro-cGMPが軟骨細胞増殖を促進し骨伸長を促すことを見出した。さらに、破骨細胞前駆細胞では、炎症性サイトカインにより8-nitro-cGMPの生成が亢進すること、生じた8-niotro-cGMPが破骨細胞分化を促進することを明らかにした。これは、炎症性骨吸収のメカニズムの一部を説明するものである可能性がある。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2015-04-01 - 2018-03-31

【配分額】17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)

【研究分野】物理系薬学

【研究領域課題番号】23249004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

生物発光 / ルシフェラーゼ / ルシフェリン / 電子移動 / 細胞膜透過性 / 一酸化窒素 / 活性酸素 / プローブ / エネルギー共鳴移動 / 近赤外蛍光 / 光増感剤 / インビボ

【研究成果の概要】

現代の生物学では、特定の応答が起きた時だけ蛍光を発する機能を持つ「蛍光プローブ」分子を活用して、各種の細胞応答を細胞が生きている状態で観測する技法が汎用されている。しかし動物個体内の細胞応答の観測は、光の組織透過性が悪いため、一般に困難である。そこで本研究では、ホタルの発する生物発光システムに適用可能な、生物発光プローブを開発し、蛍光法では達成できなかった深部のイメージングを可能とするシステムの構築を目指した。その結果、組織透過性の良い近赤外発光を示すルシフェリン誘導体や、特定の細胞応答に対応して生物発光を与えるルシフェリンプローブの開発に成功した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2011-05-31 - 2014-03-31

【配分額】49,140千円 (直接経費: 37,800千円、間接経費: 11,340千円)

【研究分野】化学系薬学

【研究領域課題番号】12470475 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛍光 / プローブ / FRET / PET / 加水分解酵素 / 一酸化窒素 / 亜鉛イオン / 活性酵素 / 活性酸素 / ERET

【研究成果の概要】

21世紀の生命科学として、"生きている状態"の細胞あるいは生体組織から生体分子を時々刻々の動的変化に対応して捉え、真の生命現象を解析する研究が重要視されている。このためには従来に無い画期的バイオイメージング技術の開発が求められている。本研究は「蛍光発光原理解明のための有機化学」を研究課題としているが、これは生体組織から生体成分を検出するバイオイメージングプローブの創製を最終目標としている。
まず、はじめに蛍光発光の原理としてPhotoinduced Electron Transfer (PET)機構の詳細な解析を行い、それに基づいて一酸化窒素(NO)、亜鉛イオン、活性酸素さらには一重項酸素のプローブの開発に成功した。さらに、別の機構であるFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)の詳細な解析を行った。FRETにおける励起エネルギー移動速度定数はFoerster式に規定されるが、これは具体的には(1)ドナーとアクセプターの相対的モーメントの向き(配向因子)、(2)ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なりの程度(重なり積分)、(3)ドナーとアクセプターの距離、の三点が重要であることを示している。我々は(2)と(3)に基づいた蛍光特性の変化を精査し、その検討に基づいて、protein tyrosine phosphataseとphosphodiesteraseのプローブ開発に成功した。これらの原理に基づく発光特性の変化は普遍性があり、他の生体分子プローブの創製にも応用できるものであり、この点から本科学研究費補助金で行われた研究プロジェクトは大成功であったと総括できる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2000 - 2002

【配分額】13,700千円 (直接経費: 13,700千円)

【研究分野】無機化学

【研究領域課題番号】09894020 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

精密金属錯体 / 分子設計 / シグナル伝達 / 活性酸素 / インスリン / 光感受性色素 / 酸素化酵素 / 一酸化窒素

【研究成果の概要】

本研究者らはこの基盤研究を現在最も活発に研究活動を行っている中堅の教授・助教授で組織し、1)精密金属錯体の合成、2)精密金属錯体の機能評価、3)精密金属錯体の機能解析、の3点に焦点を絞り、重点領域研究への発展を期して企画調査を行った。
具体的方針として、生体機能を発揮する事を目的として配位子の合成および金属錯体の調整を行い、それらを培養細胞、生体組織、酵素系に応用し、その機能を評価する。さらに機能発現の作用機構を解析し、得られた知見を分子設計にフィードバックすることを目的に、研究企画を行った。その結果、この様な多分野にまたがる研究は従来の固定した領域の研究者だけではなし得ないものであり、共同研究により初めて実りあるものとなる事が明らかとなった。テーマとしては遺伝子機能に関する研究、活性酸素・フリーラジカルに関する研究、金属酵素関連疾病に関する研究を取り上げた。
具体的には国際シンポジウムを東京で開催した。本会議は外国からの招待講演者4名、日本人招待講演者3名を含め、約100名のシンポジウム参加者により熱気溢れる討論が行われた。C.Oriving(Univ.British Colombia),M.P.Suh(Seoul National Univ.),Zalewski(Univ.Adelaide),X.-Y.Li(Hong Kong Univ.Sci.Tech.)H.Mihara(Tokyo Inst.Tech.),O.Ogawa(Lederle,Japan),K.Kikuchi(Univ.Tokyo)の口頭発表とポスターによる発表32件。いずれも最先端の研究でこの境界領域が新しい研究分野として芽生えつつあることを感じさせた。さらに第2回目の会合として本年(平成10年)1月20日に東京大学山上会館で研究会議を行い、現在までの研究の進捗状況と今後の活動方針等を討議した。
これらの成果に基づき、さらにこの分野を発展させるべく平成10年度発足の特定研究への申請を行った。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1997

【配分額】3,000千円 (直接経費: 3,000千円)

【研究分野】無機化学

【研究領域課題番号】09304061 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

スーパーオキシド / 一酸化窒素 / 亜鉛イオン / 蛍光プローブ / 活性酸素 / バイオイメージング / 一酸化窒素合成酵素 / スーパーオキシドディスムターゼ / 光線力学療法

【研究成果の概要】

本研究においては生体機能を探索することを目的に金属錯体のデザイン合成が行われた。金属イオンは微量で重要な生理作用を有するにもかかわらず、分子レベルでの解析は十分になされてこなかった。また薬理学観点からも金属錯体を医薬品として使用する試みもシスプラチンあるいは生体画像化プローブのGdイオンなど限られた例が知られているだけであった。本研究では生理活性の発現を目的とした下記の3項目の金属錯体について重点的に検討した。
1.生理活性種としての亜鉛イオンの動的機能解析
亜鉛イオンは生体中に鉄イオンに次いで多量に存在する金属イオンで、近年、その生理機能が注目されている。本研究は亜鉛イオンを培養細胞あるいは生体組織からバイオイメージングとして捉える事を目的に行われたもので、感度、特異性、pHに対する安定性、錯体生成速度など、いずれの点においても満足できる亜鉛生細胞プローブの開発に成功した。
2.生理活性種一酸化窒素(NO)の生体作用機序の解析
NOは免疫系、神経系、循環器系など全く異なる生体部位で異なる作用を示す。その作用機構はグアニレートサイクラーゼ酵素の活性中心にあるポルフィリンに配位することにより情報伝達物質として働いている。今回、第5配位がイミダソール、チオールおよび水素結合型チオールのポルフィリン錯体を合成し、それらのNO錯体の動的挙動と酵素機能の相関を検討した。
3.SOD活性化合物の開発とその医療への応用
スーパーオキシドが炎症に深く関係していることが報告されているが、スーパーオキシド不均化酵素(SOD)は酵素であるため細胞内への透過性も悪く、医薬品への応用は難しい状況にある。この研究ではSOD活性を有する合成小分子錯体を合成し、その活性を精査した結果、実用化への有用な知見を得た。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1997 - 1999

【配分額】33,000千円 (直接経費: 33,000千円)

【研究分野】化学系薬学

【研究領域課題番号】09672157 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

N-ニトロソジアルキルアミン / 変異原性 / 活性酸素 / 一酸化窒素 / ヒドロキシルラジカル / 酸化 / シトクロムP450 / 代謝活性化

【研究成果の概要】

環境内発がん物質であり、また生体内でも生成するN-ニトロソジアルキルアミンは、それ自身では生物活性はなく、生体内でシトクロムP450により酸化的に代謝活性化を受け、発がん性および変異原性を示すとされている。化学的酸化モデル系として鉄-銅-過酸化水素を用いて、N-ニトロン-N-メチルブチルアミン(NMB)を酸化すると、代謝活性化を必要としない強力な直接的変異原性化合物(mutagen X)が生成することを既に見いだした。この変異原性化合物の生成に関わる因子を検索し、変異原性化合物の同定および生成機構を解明することにより、N-ニトロソジアルキルアミンの未知の活性化経路が存在する可能性を見いだすことを目的とし、前年度において鉄、銅、過酸化水素、NOの役割を明らかにした。本年度は、基質をN-ニトロソ-N-メチルペンチルアミン(NMP)に換え、鉄-銅-過酸化水素-NO系で反応を行ったところNMBと同程度の変異原性化合物(mutagen Y)が生成することを見出した。Mutagen Yの生成における鉄、銅、過酸化水素、NOの役割もMutagen Xの場合と同じであり、同様の機構で生成すると考えられた。Mutagenを変異原性を指標に単離精製し各種機器分析を行ったところmutagen Xと類似した構造であることも明らかにした。いずれの変異原物質もアミンのγ位酸化を含む機構で生成すると考えられる6員環構造を有している。本結果は、シトクロムP450とは異なったN-ニトロソジアルキルアミン類の新たな活性化機構の一般性を示すと共に、アミンのγ位特異的な反応を経由していることから立体的要因が重要であると考えられる。活性酸素、NOともに生体内の免疫系などで生成しておりN-ニトロソジアルキルアミン類が生体内で同様に活性化される可能性が考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】3,200千円 (直接経費: 3,200千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】07670613 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝癌 / Kupffer細胞 / NO / TNF-α / NF-κB / 接着因子 / apoptosis / 共焦点レーザー顕微鏡 / 活性酸素 / Nitric Oxide (NO) / ミトコンドリア / アポトーシス

【研究成果の概要】

初年度(平成7年度)においては、Kupffer細胞によるNO・TNF-α放出動態と肝癌細胞障害・アポトーシスとの時間的空間的相関およびその制御機構を解明してきた。すなわちKupffer細胞と肝癌細胞の共培養系におけるNOおよびTNF-α産生動態の定量と、肝癌細胞内ミトコンドリア呼吸能の変化、細胞膜・核膜障害、DNA fragmentation化を共焦点レーザー顕微鏡下に可視化、定量するシステムを確立した。次年度(平成8年度)においては、NO・TNF-α合成系の関与を裏付けるためにinducible NO synthase(iNOS)mRNAおよびTNF-α mRNAに対するアンチセンスプローブを用いて抑制実験を行なったほか、fluorescence in situ hybridization(FISH)法を応用し培養細胞内iNOSおよびTNF-α mRNAの誘導を確認した。さらに各種接着因子(ICAM-1、CD18等)に対するモノクローナル抗体を用いて上述の実験系に対する抑制実験を行った。以上の結果、肝癌細胞とのICAM-1、CD18を介した接着によりKupffer細胞のNO・TNF-α合成が増加し、肝癌細胞にnecrosisのみならずapoptosisが惹起されることが明らかとなった。さらに共焦点レーザー顕微鏡的観察と組み合わせたFluorescence in situ DNA-protein結合法の開発により活性化した転写因子(NF-κ B)がKupffer細胞におけるiNOS mRNAおよびTNF-α mRNAの誘導に関与していることを証明することに成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1995 - 1996

【配分額】2,500千円 (直接経費: 2,500千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】02557036 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

微小循環 / 酸素ストレス / 癌細胞 / 細胞障害活性 / Kupffer細胞 / 好中球 / nitric oxide / デジタル生体顕微鏡 / 脂質過酸化反応 / 肝障害 / redox state / 細胞障害性 / 活性酸素 / デジタル画像解析 / 臓器微小循環 / 虚血性肝障害 / クッパ-細胞 / ヒト肝癌細胞株 / NADH自家蛍光

【研究成果の概要】

当該年度では,臓器微小循環における酸素ストレスの動的解析を特に癌細胞に対する細胞障害性の面から検討した.腫瘍細胞が生体内に発生すると,まず免疫担当細胞の攻撃を受け,この攻撃から免れた腫瘍細胞がクローン化して臨床的に癌と把握されるわけである.平成3年度までに得られた結果から,生体内では酸素ストレスが種々の細胞に対して障害性を発揮していることが明らかとなった.従って,癌細胞に対する障害細胞に酸素ストレスを生ずる能力が強ければ,その細胞は癌細胞を排除する能力も大きいと判断される.大腸癌の肝転移モデルを作製し,肝臓に流入した大腸癌細胞に対して肝内のKupffer細胞が酸素ストレスを介して障害することをin vitro,in vivoで証明した.別に,ラット肝癌細胞とラットKupffer細胞を用いてoxidativecytotoxicityを解析した.Kupffer細胞は癌細胞のミトコンドリア機能を障害することが蛍光色素であるローダミン123を用いた実験で明らかとなった.この作用はnitric axide(NO)の阻害剤で阻止されたことからKupffer細胞のミトコンドリア機能を介した細胞障害作用はNOによるものと考えられた.さらにこの作用は癌細胞とKupffer細胞の接着が必要で,その際,細胞接着分子ICAM-1の関与が示唆されている.ヒトの系においてはヒト肝癌細胞とヒト好中球の反応を検討した.好中球の細胞障害活性は酸素ストレスを介したものであり,この作用は免疫賦活剤であるOK-432により有意に増強した.しかし,リンパ球の細胞障害は酸素ストレスとは無関係であり,両者の細胞の障害機序は全く違うものであることが証明された.以上の現象をin vivoにて検討する目的でヌードマウスにヒト肝癌細胞を移植し,その腫瘍を生体顕微鏡下に観察したが,腫瘍の形状が不整で,しかも堅い性状であるため腫瘍内の臓器微小循環の観察がたいへん困難であった.今後の課題である.

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1990 - 1992

【配分額】16,800千円 (直接経費: 16,800千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】02454237 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

活性酸素 / 肝微小循環 / 四塩化炭素 / 虚血障害 / 内毒素 / nitric oxide / キサンチン酸化酵素 / デジタル画像解析 / NADH自家蛍光 / redox state

【研究成果の概要】

ラット分離潅流肝を用い,高感度カメラを接続した蛍光顕微鏡下に,肝微小循環単位を観察し,各種の蛍光プローベの蛍光強度を解析し,酸素ストレスの肝障害発生機序における意義について検討した。先づ,四塩化炭素肝障害において,過酸化脂質感受性蛍光プローベとしてdichlorofluorescin(DCFH)を用い,DCFHが過酸化脂質と反応して生じるDCFの蛍光像を解析し,終末肝静脈域(Zone3)から酸素ストレスが生じることを明らかにした。このモデルにおいて細胞障害のプローベとしてpropidium iodide(PI)の核染色像は,DCFの上昇より遅れてみられ,またcytochrome P-450の阻害剤であるSKF-525Aはこの双方の反応を抑制することが明らかとなった。次に潅流速度を通常の25%に低下させた低潅流性虚血障害においても同様の実験を行ない,DCFの上昇はZone2にみられ,Zone3へと拡がること,そしてP1の増悪もZone2からZone3に遅れてみられることを明らかにした。またミトコンドリアの機能の指標としてrhodamine123(Rh123)を用い,Rh123の低下がZone3に出現することを明らかにした。この変化は,PGE_1やキサンチン酸化酵素の阻害剤であるアロプリノールの添加により抑制されることが示された。細菌内毒素(LPS)による肝障害におけるnitric oxide(NO)の関与について検討した。LPSの添加によりRh123によりみたミトコンドリアの機能低下がZone3に強くみられたが,NOの合成阻害剤であるL-N^G-monomethyl arginineの添加により抑制されNOがLPSによるミトコンドリア障害に関与していると考えられた。これを遊離した肝細胞,Kupffer細胞において検討したところ,Kupffer細胞が同時に存在する時にのみ肝細胞のミトコンドリア機能低下が観察され,LPSにより活性化されたKupffer細胞より放出されたNOが,細胞障害に関与している可能性が示された。

【研究種目】一般研究(B)

【研究期間】1990 - 1991

【配分額】7,000千円 (直接経費: 7,000千円)