【研究分野】麻酔・蘇生学

【研究領域課題番号】13557132 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

heme oxygenase / Oxygen carrier / Hemoglobin / microcirculation / nitric oxide / bilirubin / carbon monoxide / Kupffer cells / NO / CO / 微小循環 / ヘモグロビン / バイオイメージング / ビリルビン / hme oxygenase / リポソーム / 一酸化炭素 / 酸素 / ヘムオキシゲナーゼ / シトクロームP450 / 肝臓

【研究成果の概要】

肝臓・網内系は修飾ヘモグロビン(Hb)の主要な代謝コンパートメントである。ショック病態で救急救命に使用できる酸素運搬体はこれらの病態においても肝臓の恒常性を維持しつつ循環動態を改善できるスペックを持つ必要がある。本研究ではショック病態の肝臓ではヘムの分解代謝の動態が劇的に変動し、通常では考えられないような速度で肝臓に取り込まれたヘムがbilirubinに変換されることを明らかにした。これはストレス応答によりヘム分解酵素であるheme oxygenase (HO)-1が肝臓実質とKupffer cellで誘導されるためである。このような状況で肝臓に大量のHbが負荷されると肝臓の血流と胆汁を維持しているCOが捕捉、消去されてしまうため、血流低下や胆汁低下を来たすことが明らかになった。ヘモグロビン(Hb)を径250ミクロン大のliposomeに封入、表面をpolyethylene glycolで修飾して、血小板活性化能のない新規脂質で安定化させた試料を投与すると、そのような急速なヘムの分解や分解系酵素の誘導が抑制され、肝臓の血流や胆汁分泌が維持された。またビリルビンの表面修飾によりNOによるHbのメト化も部分的に抑制された。本研究ではHb-based oxygen carrierを体内投与した際に生じうる血管内皮細胞の機能変動をin vivoで評価する系としてNOのbioimaging技術を確立し、腸間膜における血管内皮細胞由来のNOのリソースについて重要な知見を得た。これまでNOのリソースは血管内皮と神経系と考えられてきたが、我々の得た知見は赤血球から供給されるリソースの存在を示唆するものであった。このような知見からHbを修飾した酸素運搬体ではこのような血流代償作用が期待できないことが示唆され、リポソーム型の場合であっても、血管内空間でリサイクルされるNOにどの程度の影響を与えるのかをさらに詳細に解析していく必要があると考えられた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】医薬分子機能学

【研究領域課題番号】11470494 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

シトクロムP450 / 一酸化窒素 / NO合成酵素 / チオレート / ポルフィリン / 酸化 / 水素結合 / 酵素阻害剤 / ヘムーチオレート / 活性腫 / 過酸 / ヘム / NO / ペプチド / アイソザイム / 阻害剤 / 発現系

【研究成果の概要】

1)ヘムの反応特性に関し開発した唯一の安定型ヘムーチオレート錯体(SR錯体)を開発してきたが、この配位構造と一酸化窒素(NO)との配位化学を世界に先駆けて詳細に検討することに成功した。SR錯体はNOと安定で可逆的な錯形成を行いその錯形成定数において顕著な軸配位子効果が認められた。本研究でチオレート配位であることにより鉄へのNO配位力は他の錯構造より大きく弱められていることがわかり、本酵素の生成物阻害に関する議論に対して強い示唆を与える結果である。
2)シトクロムP450において軸配位子部のNH-S水素結合の存在が確認されている。このNH-S水素結合を有する活性中心モデルを合成し、水素結合を有さないモデルとの比較を行った。その結果、水素結合を受けることにより鉄一硫黄結合距離が短くなること、酸化活性種の求親電子性が高まることを見いだし、ヘムーチオレート構造の触媒機能に及ぼすNH-S水素結合の効果を初めて明らかにした。
以上1)、2)よりシトクロムP450、NO合成酵素で興味を持たれながら未解明であった構造と機能の関連について重要な点を明らかにできた。
3)P-450を強く配位阻害する新規骨格をSR錯体をプローブとし見いだし,新たな医薬創製に役立てる事を目的に,特に有効な阻害剤のないNOSの活性を制御する化合物の探索を行い,高い選択性を有する阻害剤の開発に成功した。ヒト酵素での高い選択性と活性を有する阻害剤を求めて構造活性相関を行い、その結果ジペプチドであるL-イソチオシトルリニルL-アミノ酸がヒトiNOS選択的に酵素阻害を起こすことを見いだした。これによりヒトiNOSの基質結合部位のC末部位に一定の疎水基親和性のある部位が存在するという本研究者の作業仮説を裏付ける結果が得られた。本知見は有効なNOS阻害に基づく治療薬設計の一指針になると考えられる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】12,500千円 (直接経費: 12,500千円)

【研究分野】内科学一般

【研究領域課題番号】07457126 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

更年期 / 高血圧 / 食塩感受性 / Dahl食塩感受性ラット / Pressure natriuresis curve / Intracellular calcium / Protein kinase C / Nitric oxide / NO / 筋小胞体Caポンプ / 更年期高血圧 / 細胞内カルシウム代謝 / 卵巣摘出術 / 圧利尿反応 / 血小板 / エストロゲン / ダールラット

【研究成果の概要】

女性において更年期以降、心血管系疾患が急激に増加することが知られている。しかし、その主たる要因となる更年期高血圧の病態はほとんど検討されていない。更年期高血圧の臨床的特徴は食塩を過剰摂取した際に血圧が上昇する食塩感受性である。雄性のDahl食塩感受性(DS)ラットに高食塩食を与えると顕著な高血圧を発症するのに対し、雌性DSラットは血圧が上昇せず、雌雄差がはなはだしい。まず、雌性DSラットに卵巣摘出を行い、高食塩食を与える(OVX+Salt DSラット)と著しく血圧が上昇することを示した。更年期高血圧の食塩感受性において、腎が1つの臓器としてNa排泄能を十分果しているかについて検討した。Pressure-Natriuresis Curveの特性を解析し、OVXDSラットでNa排泄能が低下していることを明らかにした。
つぎに、細胞レベルで高血圧の成因として深く関与する細胞内Ca動態の異常について研究を進めた。OVX+Salt DSラットは高血圧を発症しても細胞内Ca濃度の増加は伴わず、細胞内Ca貯蔵量は減少することが明らかとなった。この結果は2型筋小胞体Caポンプ遺伝子のmRNA発現量の低下と一致した。OVX+Salt DSラットにおいて細胞内Caの増加を伴わずに血小板凝集能が亢進した機構を検討した。OVX+Salt DSラットの血小板凝集能亢進にProtein Kinase Cの活性化とNitric Oxide合成酵素の抑制が関与することを明らかにした。さらに卵巣摘出による高血圧および血小板凝集能の亢進はエストロゲンの補充により改善することも確認した。
以上の結果より、更年期高血圧はエストロゲンの欠乏を介して、腎におけるNa排泄能が低下し食塩感受性を呈すること、細胞内Ca貯蔵量の減少および血小板凝集能の亢進を合併すること、さらに、血小板凝集能の亢進にはPKCの活性化とNO産生の低下が関与することを示した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1995 - 1996

【配分額】5,200千円 (直接経費: 5,200千円)

【研究分野】消化器内科学

【研究領域課題番号】07670613 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

肝癌 / Kupffer細胞 / NO / TNF-α / NF-κB / 接着因子 / apoptosis / 共焦点レーザー顕微鏡 / 活性酸素 / Nitric Oxide (NO) / ミトコンドリア / アポトーシス

【研究成果の概要】

初年度(平成7年度)においては、Kupffer細胞によるNO・TNF-α放出動態と肝癌細胞障害・アポトーシスとの時間的空間的相関およびその制御機構を解明してきた。すなわちKupffer細胞と肝癌細胞の共培養系におけるNOおよびTNF-α産生動態の定量と、肝癌細胞内ミトコンドリア呼吸能の変化、細胞膜・核膜障害、DNA fragmentation化を共焦点レーザー顕微鏡下に可視化、定量するシステムを確立した。次年度(平成8年度)においては、NO・TNF-α合成系の関与を裏付けるためにinducible NO synthase(iNOS)mRNAおよびTNF-α mRNAに対するアンチセンスプローブを用いて抑制実験を行なったほか、fluorescence in situ hybridization(FISH)法を応用し培養細胞内iNOSおよびTNF-α mRNAの誘導を確認した。さらに各種接着因子(ICAM-1、CD18等)に対するモノクローナル抗体を用いて上述の実験系に対する抑制実験を行った。以上の結果、肝癌細胞とのICAM-1、CD18を介した接着によりKupffer細胞のNO・TNF-α合成が増加し、肝癌細胞にnecrosisのみならずapoptosisが惹起されることが明らかとなった。さらに共焦点レーザー顕微鏡的観察と組み合わせたFluorescence in situ DNA-protein結合法の開発により活性化した転写因子(NF-κ B)がKupffer細胞におけるiNOS mRNAおよびTNF-α mRNAの誘導に関与していることを証明することに成功した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】1995 - 1996

【配分額】2,500千円 (直接経費: 2,500千円)

【研究分野】超高層物理学

【研究領域課題番号】01840015 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

総窒素酸化物 / 一酸化窒素 / NOy / NO / 気球観測 / コンバ-タ- / 化学蛍光法 / 気球測定 / 成層圏

【研究成果の概要】

成層圏の総窒素酸化物(NOy)と一酸化窒素(NO)の同時測定装置の開発を2年間にわたり実施した。このためまずNOyをNOに効率良く変換するためのコンバ-タ-の製作を行なった。このコンバ-タ-は300ﾟCに加熱した金の表面上で、一酸化炭素(CO)を還元剤としてNOyをNOに変換するという原理に基づくものである。コンバ-タ-は内径5.7mm、厚さ0.15mm、長さ30cmの金管を19本束ねたユニットを内径30.5cm、長さ50cmのステンレス管に収納するという構造のものを製作した。このように断面積を大きく取ることにより、コンバ-タ-による圧力損失を最小限に押えることができた。また精密な温度制御装置によりコンバ-タ-温度を±1ﾟCの精度で一定に保つことができた。試料大気をコンバ-タ-を通すか、あるいはバイパスするかでNOy又はNO測定と切り換えられるような空気左動弁を設計・製作した。NOyコンバ-タ-を化学蛍光法NO検出器と結合してNOy測定器を構成し、コンバ-タ-のテストを行なった。100から3mbの範囲でNO_2に対する変換効率は99%と一定であることが確かめられた。また数PPmVのオゾンの存在下でもこの変換効率は変化しないことも確められた。硝酸に対する変換効率は校正ガスの精度の点で10%の不確定性をもつが、この範囲では100±10%の変換効率をもつことを確かめた。組み上げた測定器は1990年1月にスウェ-デンの大型気球実験で使用され、初めて極域での高精度のNOyの測定に成功した。また1990年9月にはフランスでの気球実験により、NOyとNOの同時観測に世界で初めて成功した。このように実験室での開発と野外での気球実験において、本研究の目的は十分に達成できた。今後装置の小型・軽量化を行なうことにより更に多くの気球実験に用いることができるのであろう。

【研究種目】試験研究(B)

【研究期間】1989 - 1990

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)