【研究領域課題番号】22K14777 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ペプチド / タンパク質 / アミノ酸 / 相分離 / 沈澱

【研究種目】若手研究

【研究期間】2022-04-01 - 2025-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究領域課題番号】21K20622 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ペプチド / バイオセンサ / パターン認識 / タンパク質 / 液-液相分離

【研究種目】研究活動スタート支援

【研究期間】2021-08-30 - 2023-03-31

【配分額】3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)

【研究領域課題番号】21K06482 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ペプチド / タンパク質 / 化学修飾 / 銅イオン / アルドール反応 / ペプチド結合 / 配向基

【研究成果の概要】

抗体―薬物複合体などのバイオ医薬品創薬やケミカルバイオロジーの基礎研究において、薬物や蛍光分子などの人工分子をタンパク質の特定の位置に選択的に結合する技術（化学修飾法）が欠かせない。化学修飾法に用いる有機反応は、水溶液中、温和な反応条件（4ー50℃、pH5ー9程度、など）下、進行することが求められる。2000年以降、化学修飾法の研究は進展し、システイン、チロシン、トリプトファン、メチオニンなどの特徴的な反応性を利用した付加反応、酸化還元反応などによる化学修飾が報告された。しかし、これらの手法は対象のタンパク質が上記アミノ酸を持たない場合には適用できない。このような背景のもと、ポリペプチド鎖中に必ず１箇所存在するN末端アミノ酸を活用した化学修飾法を検討した。N末端にイミン形成を介して一時的に結合した配向基を利用すれば、クロスカップリング反応でN末端近傍のアミノ酸を化学修飾できると考えた。
本年度は、市販の生理活性ペプチドに対し、種々の芳香族アルデヒドを一時的配向基として用いるカップリング反応を試みた。すると予期せぬことに、銅イオン存在下、2-ピリジンカルボキシアルデヒドを作用させると、N末端アミノ酸がアルドール反応し、選択的に化学修飾されることを見出した。この反応は種々の生理活性ペプチド、タンパク質に対しても同様に進行し、N末端アミノ酸を選択的に化学修飾することができた。当初目的としたカップリング反応では無いが、新たな形式の化学修飾法を開発することができた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2021-04-01 - 2024-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究領域課題番号】19K15692 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ペプトイド / ペプチド / 人工オリゴマー / タンパク質 / 分子認識 / N置換ペプチド / タンパク質リガンド / ３次元構造解析 / 固相合成 / フォルダマー / 立体構造解析 / 固相合成法 / 生体分子認識 / タンパク質間相互作用

【研究成果の概要】

本研究では、生体分子とくにタンパク質の精密認識を実現する人工オリゴマー分子の創出を目標に研究を実施した。ペプトイド（ペプチドもどき）として知られる分子の主鎖を改変するアプローチにより、特定の３次元構造を安定に形成する人工オリゴマー分子を創出することに成功した。この分子を用いることで、実際にタンパク質表面を認識する分子を創出することに成功し、分子生物学研究に有用なケミカルツールや創薬研究におけるシーズを提供する分子技術の基盤を築いた。

【研究の社会的意義】

タンパク質は、生体機能の発現に主要な役割を果たしており、その機能の自在に制御できる分子の創出は、分子生物学などの基礎研究や創薬のような応用研究において重要な研究課題である。本研究では、ペプトイドと呼ばれる人工分子の研究に着手し、最終的に、タンパク質表面を認識して結合する分子を創出することに成功した。このペプトイドの研究を今後さらに発展させることで、タンパク質機能を自在に制御可能となれば、生命科学分野の基礎研究および創薬における大きな波及効果があると考えている。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2019-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究領域課題番号】19K16321 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ペプチド / タンパク質 / 化学修飾 / クロスカップリング / ボロン酸 / 銅 / ニッケル / トリプトファン / ラジカル反応 / 遷移金属 / チオエーテル / アミノ酸 / 金属イオン

【研究成果の概要】

ペプチドやタンパク質は約20種類のアミノ酸が連結してできたポリマーである。本研究では、銅イオンを利用したクロスカップリング反応でチロシン残基に人工分子を結合する手法（化学修飾法）を開発した。しかし反応条件は過酷でタンパク質中のチロシン残基の化学修飾には応用できなかった。
上記研究と並行して、申請者が以前報告したシステインの化学修飾法を基にニッケルイオンを用いて炭素-硫黄結合を形成する有機合成反応を開発した。弱塩基性、空気中、室温という温和な条件で種々のスルフィドが合成できた。

【研究の社会的意義】

ペプチドやタンパク質は多数のアミノ酸が連結してできたポリマーである。同じアミノ酸が複数含まれるだけでなく、似た性質のアミノ酸も存在するため、特定の箇所にのみ人工分子を結合させること（化学修飾）は難しい。化学修飾は、化学や生物の基礎研究だけでなく、創薬など産業的にも広く利用されている。これまで、システインが化学修飾に利用されてきたが、システインを含有しない場合、他のアミノ酸を化学修飾する必要がある。本研究成果は反応条件の改善が必要ではあるものの、チロシンを化学修飾する手法として有望である。

【研究種目】若手研究

【研究期間】2019-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究領域課題番号】19H03348 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質 / 化学合成 / 触媒 / ペプチド / ピリジン

【研究成果の概要】

タンパク質はそのアミノ酸配列情報に加え、様々な化学修飾を受けて多様な機能を獲得し、生命活動の構造的・機能的根幹を成している。したがって、その機能解析、あるいはその機能を生化学的・治療的用途に用いることは重要である。その目的のために各種タンパク質合成法が開発されており、中でも短いペプチド同士を連結することで大きなタンパク質を合成する化学合成的手法がもっとも頻繁に用いられている。しかしその成熟度は十分でなく、主には連結位置がシステインに限定されるという課題がある。本研究では、既存法とは全く異なるアプローチによって、いかなるアミノ酸位置でのペプチド連結反応を可能にする触媒を開発し、タンパク質の化学合成が抱える課題を根本的に解決することを目指す。
これまでにペプチドC末端を活性化する触媒を見出すことに成功している。並行してペプチドN末端を活性化する触媒構造について検討した結果、活性は十分ではないものの候補となる骨格を見出している。令和３年度までに当該C末端活性化触媒とN末端活性化構造を同時に持つ触媒の探索を進めてきたが、両方を満足する触媒を見出すことに成功していない。令和３年度は、別研究で見出した新規かつ高活性なペプチドC末端活性化触媒骨格へと母骨格を変更し、これにペプチドN末端を活性化する構造を融合することを検討した。しかし、ペプチドC末端、N末端を同時に活性化しうる触媒の発見には現在のところ至らなかった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2019-04-01 - 2023-03-31

【配分額】17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)

【研究分野】生体医工学・生体材料学

【研究領域課題番号】17H02103 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

抗体 / ペプチド / 核酸 / ドラッグデリバリーシステム / 細胞膜透過 / 蛋白質 / 癌 / バイオテクノロジー / 共焦点顕微鏡

【研究成果の概要】

標的分子に対して高い特異性と親和性をもつ抗体／ペプチド／核酸などのバイオ医薬は、従来の低分子化合物医薬と比べて副作用が少なく、治療効果が高い究極の分子標的薬として注目されているが、細胞膜透過性が低いという欠点があり、効率のよいドラッグデリバリーシステム（DDS）の開発が求められていた。本研究では、我々が発見した膜透過促進ペプチドを利用して、抗体／ペプチド／核酸を従来よりも効率よく細胞質に送達できることを示した。また、基礎研究として、その膜透過促進メカニズムの解明も並行して進めた。

【研究の社会的意義】

我々が発見した膜透過促進ペプチドはヒト天然タンパク質由来であり免疫原性の懸念が少ないという利点もあることから、この独自の膜透過促進ペプチドを連結した抗体／ペプチド／核酸がヒト細胞の細胞質に効率よく送達されるという本研究の成果は、将来的に、細胞内の疾患標的に作用する新しい抗体医薬の開発や、ペプチドや核酸からなる中分子医薬の効率的なデリバリーに応用することが期待できる。これにより、我が国のバイオ創薬技術の基盤強化、ひいては国民の医療・福祉の向上に大きく貢献することが期待できる。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2017-04-01 - 2020-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究分野】応用生物化学

【研究領域課題番号】24780104 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

情報伝達 / フェロモン / ＮＭＲ / 立体構造 / 相互作用 / マウス / ＧＰＣＲ / ぺプチド / 構造生物学 / タンパク質 / NMR / GPCR / 分子認識

【研究成果の概要】

多くの生物は，種を保存するため，異性を正確に認識する情報手段として「フェロモン」を用いる。共同研究者である東京大学の東原らは，オスマウスの涙に分泌され，メスマウスの性行動を誘発するペプチド性フェロモン ESP1 を同定した（Nature, 2005）。また，鼻腔下部の鋤鼻器官にある GPCR クラス C 受容体の V2Rp5 を介して機能することを明らかにした（Nature, 2010）。
本研究代表者らは，ESP1の立体構造を決定し，その情報をもとに受容体との結合様式を明らかにした（JBC, 2013）。本研究により，哺乳類のペプチド性フェロモンと受容体の構造的知見を初めて得た。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2012-04-01 - 2014-03-31

【配分額】4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)

【研究分野】生物機能・バイオプロセス

【研究領域課題番号】23656518 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛍光標識 / 酵素 / 動物細胞 / タンパク質 / ペプチド / スプリットタグ / 細胞内導入 / ターンオンプローブ / トリプトファンジッパー / 細胞 / ペプチド連結酵素

【研究成果の概要】

酵素を用いてタンパク質へ特異的に標識可能であり、また、標識して初めて蛍光を発するようなタグ配列-蛍光ラベル化剤のペアの開発を行った。その結果、ソルターゼによる特異的な連結反応後に2.6倍に蛍光が増大するペアを創製できた。そこで、細胞内での標識を可能にするため、細胞外で発現精製した連鎖球菌由来ソルターゼAを細胞内に導入して連結反応を行う方法を開発した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】22651079 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

アミロイド線維 / アルギニン / アルツハイマー病 / 低分子化合物 / ファージディスプレイ / ペプチドライブラリー / クマリン / globulomer / SciFinder / 蛋白質 / インフォマティクス / アミロイドβ / 抗体 / ペプチド / プロドラッグ

【研究成果の概要】

タンパク質の機能改変を行うタンパク質工学においては、従来、生化学的研究とインフォマティクス的研究が独立に行われている場合が多く、タンパク質のメカニズム解明の新たなブレークスルーのためには、実験とインフォマティクスを相乗的に結びつけ新たな発見に導く融合的研究が必要である。本研究では、実験手法としてのファージディスプレイ法と、情報学的手法としての最適化を組み合わせることにより、アミロイドタンパクの凝集を阻害する新規ペプチドとそれを模倣する低分子化合物を見出すことに成功した。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2010 - 2011

【配分額】3,550千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 450千円)

【研究分野】創薬化学

【研究領域課題番号】19390032 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

医薬分子設計 / ペプチド / コラーゲン / スクリーニング / タンパク質

【研究成果の概要】

コラーゲン結合性をもつ種々の生理活性タンパク質に対する阻害剤を取得するためのhigh-throughput screening系を確立した。この系を用いて、シャペロンHSP47、血液凝固に関わるGlycoprotein VI(GPVI)、von Willebrand因子(VWF)、血管新生阻害活性をもつ色素上皮由来因子(PEDF)、クロストリジウム菌コラゲナーゼに対する阻害剤候補化合物を得た。PEDFに結合性を示したペプチドの構造-活性相関研究から、PEDFの血管新生阻害活性の発現におけるへパラン硫酸プロテオグリカンの関与が示唆された。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2007 - 2010

【配分額】18,850千円 (直接経費: 14,500千円、間接経費: 4,350千円)

【研究分野】創薬化学

【研究領域課題番号】16689004 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

線維化 / コラーゲン / 分子シャペロン / ペプチド / 蛋白質

【研究成果の概要】

1.HSP47阻害剤デザインのためのペプチドシード化合物の最適化
HSP47が認識するコラーゲン3重らせん上の2つのアミノ酸残基に関して、前年度までに得られていた情報を基にして、徹底した構造活性相関データを収集した。すなわち、HSP47が認識するArg残基(第一ファーマコフォア残基)およびそのArgの3残基N-末端側にあるアミノ酸(Yaa-3:第二ファーマコフォア残基)について、非天然アミノ酸を含むシステマティックな置換を施した40種類以上のコラーゲン様ペプチドを化学合成した。それらのペプチドとHSP47との結合アフィニティーをin vitroで定量的に評価し、HSP47上に存在する「コラーゲン認識ポケット」の性状についての情報を得た。その結果、第一ファーマコフォア残基に最適なアミノ酸はArgであり、とくに側鎖グアニジノ基の存在が必須であることが明らかになった。また、第二ファーマコフォア残基に最適なアミノ酸はThrであった。
2.HSP47とコラーゲンとの結合を阻害する小分子化合物のスクリーニングについて
HSP47がin vitroでのコラーゲンの線維形成を阻害することを利用した、マルチウェルプレート対応のスクリーニングシステムを構築した。上記1で使用したペプチド性阻害剤を用いてこのスクリーニングシステムのバリデーションを行った。その結果、今回構築したシステムは従来我々が用いてきたpull-downアッセイや、BIAcoreをもちいた競合結合実験と同等の精度・感度を有することが確認され、薬物のスクリーニングに使用可能であると判断できた。

【研究種目】若手研究(A)

【研究期間】2004 - 2006

【配分額】28,080千円 (直接経費: 21,600千円、間接経費: 6,480千円)

【研究分野】化学工学一般

【研究領域課題番号】08305031 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

バイオプロセス / 分離精製 / 複合化 / 細胞破壊 / アフィニティクロマトクラフィー / 逆ミセル / 精密3過 / 水性二相抽出 / バイオプロダクツ / アフィリニティクロマトグラフィー / 精密ろ過 / タンパク質 / 粗酵素 / クロマトグラフィー / 電気泳動 / ペプチド / 水性二相系 / クロマトグラフィ / アフィヒティ

【研究成果の概要】

バイオプロセスにおける分離精製の要素技術を視野に入れて検討した。対象とした要素技術は、細胞の破壊回収、水性二相系による粗分離操作、精密ろ過膜による分離、アフィンティクロマトグラフィー、ストレス応答を利用した分離、逆ミセル分離、電気泳動法等である。
細胞の破壊回収操作では、培養段階における細胞内生産過程と生産物回収過程を複合させた効率的な生産プロセスの構築を目的として、自己破壊性細胞の開発を研究した。今後宿主-ファージ系での新規の溶菌酵素の発見が期待され、分離精製過程の短縮に結び付けられることがわかった。
精密濾過膜を改質し、荷電、疎・水性、イオン交換能を持つ精密濾過膜による、目的酵素と共存物質の吸着・脱着特性と操作条件との関係を検討し、その分離・精製への膜クロマトグラフィーの適用と、他の分離要素との複合化について考察した。
逆ミセルの分離の選択性を高めるために、バイオアフィニティ技術の逆ミセル抽出法への遵入、リン脂質を利用した生体適合性の高い逆ミセルの開発、タンパク質のリフォールティングへの応用など、複合化を目指した逆ミセルの新展開を行なった。
循環式フリーフロー電気泳動装置を改良して、泳動質外部に資料リザーバーを設けて、処理量を任意に可変可能とし、さらに連続操作を可能にした。3成分のタンパク質の連続分離操作を実験および数学的モデルのシミュレーションより、印加電圧を高くし、循環流量を押さえると、高純度の製品がえられることを示した。
その他の要素についても複合化を意識した開発、改良結果について検討し、最終報告書の形でまとめている。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】20,600千円 (直接経費: 20,600千円)

【研究分野】高分子物性・高分子材料

【研究領域課題番号】62430019 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

高分解能NMR / 高分子の高次構造 / 蛋白質 / ポリペプチド / 酵素 / シクロデキストリン / 糖蛋白質 / 人工酵素 / ^1HーNMR / ^<13>CーNMR / ^2HーNMR / イオノホア / コンホメーション / 水素結合 / 高次構造 / 高分子 / ^1HーNMMR / ペプチド / 遺伝子

【研究成果の概要】

この研究は、高分解能NMR法を主手段として生物活性を持つ高分子の種々の環境のもとでの高次構造を決定し、機能との関係を明らかにすることを目的として昭和62年度から平成元年度までの3年間にわたり実施した。主たる研究対象として(1)糖蛋白質、(2)酵素と人工酵素、(3)蛋白質モデル化合物を選び、初年度には溶液用の、2年目には固体用の高分解能NMR装置を導入し、溶液状態および固体状態でのそれぞれの高次構造を解析し、機能を解明した。研究成果の概要は以下の通り(カッコ内は分担研究者名)。課題(1)では極地の海に住む魚の血液凍結を防止する活性を持つ糖蛋白質のモデルとして、ガラクトサミン基結合スレオニン残基を含む数種のオリゴ糖ペプチドを合成し、高次構造、糖-ペプチド間相互作用などを調べ、不凍化活性発現の機構を推定した(中條,井上)。課題(2)では化学修飾基としてヒスタミン基を持つシクロデキストリン(CD)がキモトリプシン類似の触媒活性を持つことを明らかにし(戸田)、また単糖または二糖を枝として持つ分岐CDの基質認識機能における枝の役割を明らかにした(山本)。さらに結合蛋白質プロテインAとメタピロカテ-ゼを融合した蛋白質を遺伝子工学的に合成し、発現蛋白質が両蛋白質の機能を併せ持つことを認めた(相沢)。課題(3)ではポリ-γ-ベンジル-L-グルタメ-トについて高次構造の安定化に対する側鎖間相互作用の役割を明らかにし(安部)、ポリ-L-グルタミン酸塩の溶液中の構造に対する対イオンの効果を検討した(小見山)。また天然イオノホアのモデルとしてのカルボン酸型ポリエ-テルのアルカリ金属錯体の溶液中の構造をH-NMR化学シフトから検討した(中浜)。さらに固体状態の種々のペプチドおよび蛋白質トロポミオシンの高次構造を固体高分解能NMRから得られる化学シフトに基づいて検討した(安藤)。

【研究種目】一般研究(A)

【研究期間】1987 - 1989

【配分額】38,200千円 (直接経費: 38,200千円)